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1、病原生物学教研室 病原生物学实验（二）细菌接种技术实验目的1 掌握常用的细菌接种方法2 熟悉细菌生长现象的观察方法（一）细菌的分离培养和接种技术接种工具接种针和接种环L型涂布棒 接种环境接种罩、超净工作台或无菌室内进行。接种方法1. 平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分 散生长，形成单个菌落，以便 获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量 较多的标本。连续划线法：适用于含菌量 较少的标本。分区划线划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5.划线为连续划线,不能间断.应占满平皿
2、.划线不能交叉重复.每次划完后应灭菌.2.斜面接种法：用于菌种移种，以进一步鉴定和保存菌种。 3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。四 种 接 种 方 法将上述已接种细菌的培养基置37恒温培养箱中孵育1824h，观察细菌的生长现象。（二）细菌在培养基上的生长现象1. 细菌在固体培养基中的生长现象菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖， 形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、 透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落与菌苔菌落菌苔2. 细菌在
3、液体培养基中的生长现象浑浊：大多数细菌，如E.c.沉淀：多见于链状排列的细菌。菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌） 。细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌沉淀均匀浑浊对照3. 细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力 现象肠道致病菌的分离培养(1)一.肠道杆菌的生物学性状 二.S-S培养基的特性及用途 三.分离培养方法 主要内容（一）肠道杆菌的生物学性状 埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌甲型、乙型、丙型副伤寒志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科的重
4、要菌属及代表菌种1.相似的形态染色从形态上无法区别从形态上无法区别中等大小的中等大小的G G- -杆菌杆菌 多有鞭毛、菌毛多有鞭毛、菌毛 乳糖发酵试验 肠道致病菌 肠道非致病菌 多数不发酵乳糖 多数发酵乳糖 2.活泼的生化反应初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌+/- - +伤寒杆菌 - - +痢疾杆菌 - 大肠杆菌 硫化氢 乳糖 葡萄糖 菌名 三种细菌的生化反应 成 分含量（g/L ）作 用牛肉膏5营养成分乳糖10营养成分，发酵蛋白胨5营养成分胆酸钠、胆酸-脱氧胆 酸钠盐混合物（三号）3.5抑制G+、大部分大肠菌群和变形 杆菌柠檬酸钠8.5抑制G+、大部分大肠菌群和变形0.1%煌绿溶液0.33m
5、l抑制G+、大部分大肠菌群和变形硫代硫酸钠8.5检测硫化氢的产生10%柠檬酸铁溶液10ml检测硫化氢的产生1%中性红溶液2.5ml指示剂琼脂17凝固剂（二）SS培养基（Salmonella Shigella Agar ）胆盐抑制G+,枸橼酸钠和煌 绿能部分抑制大肠杆菌,致 病的沙门菌和志贺菌能大 量生长。中性红指示剂和乳糖,中中性 红遇酸变粉红。常用于肠道致病菌的分离 培养。 （二）SS培养基细 菌SS平板大肠杆菌粉红色大菌落痢疾杆菌无色细小，半透明菌落伤寒杆菌无色细小 半透明菌落 (中间有黑色沉淀）SS培养基中菌落特点 将粪便标本以平板分区划线法接种到SS培养基。(每个实验室8个SS平板，每
6、组做好标记，班长用胶布按班级绑好) 放入37温箱中培养24h；取出放4冰箱中保存备用。（三）粪便标本的分离培养1.空气中细菌的检查（每个班2个平皿） 原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液 体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气 体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方 式沉降到琼脂培养基上。方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖 扣置于皿底下，暴露放置15min，即盖上皿盖，放入37 培 养24小时，观察结果。细菌在自然界的分布2.紫外线对细菌的影响 （每个实验室2个培养皿）取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中 ，打开一半平皿盖，置于紫外灯下照射
7、30分钟 ，然后盖好平皿，置37培养24h后取出观察结 果。密涂接种密涂接种分三次接种， 每次取一环。第 一次密涂接种后 旋转60度二次密涂接种，然后同 方向旋转60度后再次密涂接种。3. 咽喉部细菌的检查（每班4个平皿） n取血琼脂平板1块，打开平皿盖，将培养基面置于 口腔前10cm处，受试者用力咳嗽几次；n盖上平皿盖，置37温箱中倒置培养24h后取出 观察结果。4.化学消毒剂对细菌的影响方法：取一普通平皿培养基， 一部分写上“前”，另一部分 写上“后”，然后将手指在写 有“前”的部分沾一下，再将 手指用酒精进行消毒，在写 有“后”的部分沾一下。放入 37温箱培养24小时后观察。 （每个实验室4个平皿）5.自选细菌进行培养(4个)方法：取一普通平皿培养基，用棉签沾取生理盐水后，在 手机、台面等物品上擦拭，然后涂布在平板上。下次实验细菌的形态学检查药敏试验肠道致病菌分离培养
