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1、实验三 药敏实验内容l一、纸片扩散法（K-B法）l二、稀释法 (MIC)实验目的l一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果 的判断及其临床意义。l二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌 株控制可变因素)。l三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理 、操作方法、结果判断及临床意义。l四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控 制可变因素)。纸片扩散法（K-B法）l器材与试剂菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色 葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓 度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5108CFU/ml) ；或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水 中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管
2、。培养基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。l原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上 ，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区 域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细 菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测 定药物的敏感程度。l方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做 临床种，每种菌选4个不同的药物纸片）1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至 60左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中，使琼脂 厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生， 可放置37 温箱中15-30分钟后使用
3、。2、无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌 液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60 ，最后沿平板內缘涂布1周。3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物 纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距 平板內缘大于15mm， 37 温箱中孵育16-18小时， 量取抑菌圈直径。l结果观察中的注意事项：1、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形 ，量其最长径和最短径，取其平均值。2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈， 而磺胺类药物则量其外圈。3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌 的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重 做。l结果观察： 1、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈
4、直径，参照书上的标 准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报 告。例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，抑菌圈14mm为耐药，15-16mm为中介， 17mm为敏感。 2、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围 内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时 查找原因，予以纠正。例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在 20-26mm之间。l思考题：影响因素？1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？2、纸片质量3、接种细菌的菌量4、孵育的温度和时间5、操作因素稀释法l微量稀释法l常量稀释法
5、（试管稀释法）常量稀释法（试管稀释法）1、实验目的：用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓 度（MIC） 2、实验原理：将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释 ，再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培 养后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对 此菌的MIC。定量的测试菌的制备l1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡 萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度 至0.5麦氏比浊管（相当于1.5108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。l2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍， 即可使用。步骤和方法 l将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度
6、，加入定量 测试菌。l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9（对照）无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1（ml）青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去(80单位）稀释的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1（ml) 37培养16-18小时l结果观察:l完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌 药对此菌的MIC。l此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC 株和临床株的MIC。l结果举例：l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1（ml）青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去(80单位）金葡菌 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 结果细菌生长 - - - - - + + + + 青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照- l结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度 为该药对检测菌的MICl影响因素？临床意义？
