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1、如何在体外表达一个基因？如何检测一个基因的表达？如何在体外表达一个基因 ？如何在体外表达一个基因基因的获取基因的克隆重组DNA技术基因的表达基因产物的鉴定表达产物的纯化获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常规方法有PCR法，基因组文库或cDNA文库法以及化学合成法。应根据具体的研究目的和实验条件选用合适的方法。基因的获取获取基因的序列在获取基因之前如果能知道基因的序列将使这一过程变得非常方便。人类基因组数据库提供了所有已知基因的序列。地址为http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/化学合成法较短的基因（100 base）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针基因组文库限制性
2、限制性 内切酶内切酶克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定基因组基因组DNADNA基因组文库基因组文库10PCR引物引物引物引物3 55 5PCR扩增目的基因基因组基因组引物设计：引物设计：（1) 1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布。碱基尽可能随机分布。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；
3、55端无严格限制端无严格限制PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶循循 环环 仪仪9494o oC5C5949455 55 72 72 加样孔琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱PCRPCR产物产物DNA Marker以基因组DNA为模板，得到的PCR产物是含有内含子的基因逆转录酶PCR（RT-PCR）RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩
4、增（达ngug水平）比基因组DNA少了内含子cDNA文库RT-PCRhttp:/www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html基因的克隆重组 DNA技术重组重组DNADNA技术作为分子医学中最重要、技术作为分子医学中最重要、 最基本的技术之一，是许多分子医学实验最基本的技术之一，是许多分子医学实验 实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中 具有举足轻重的意义。具有举足轻重的意义。20人体基因克隆Restriction enzyme EcoRI Bacterial enzyme that stops
5、viral reproduction by cleaving viral DNAAct as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA)Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of foreign DNA can be made基因重组技术需要：一个载体：质粒、噬菌体、病毒、cosmid、BAC和YAC等二个酶：限制性内切酶连接酶质粒是最常用的载体ori复制起点ori筛选基因多克隆位点（Multiple cloning site ，MCS）限制
6、性内切酶“分子剪刀”限制性内切酶和连接酶共同作用可将不同的 DNA分子连接形成重组DNA分子以质粒为载体的 DNA克隆过程切接转筛质粒转入细菌转化 (transformation)质粒转入真核细胞转染 (transfection)病毒转入细胞感染 (infection)转1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等筛：重组体的筛选(插入失活法)抗药性标记选择互补利用互补原理筛选重组体pUC18 重组DNA技术基因的表达 优点：简单、经济、产量高 不足：不宜表达真核
7、基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱、产量低 转染 将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动 物细胞）表达载体的选择表达载体必需具备转录和翻译必需的元件：启动子、起始密码子、终止密码子等原核表达载体：S-D序列真核表达载体：增强子、Poly A元件cDNA是首选对象，既可在原
8、核细胞又可在真核细胞中表达基因组DNA只能在真核细胞中表达表达产物的鉴定蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）对照对照 样品样品 分子量分子量 MarkerMarker表达蛋白生物学功能检测表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达淀粉酶基因表达表达产物的纯化分子筛分子筛亲和柱亲和柱离子交换离子交换抗原抗体抗原抗体目的蛋白目的蛋白安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC） 如何检测一个基因的表达mRNA的检测northern blotRT-PCRmRNA的定量检测实时定量PCR蛋白质的定性与定量western blot和ELISA细胞内mRNA的定位检测原位杂交细胞内蛋白
9、质的定位检测免疫组化细胞内蛋白质的定位检测荧光显微分析细胞内蛋白质的定量检测流式细胞技术核酸分子杂交序列互补的单链DNA与DNA、DNA与RNA及RNA与RNA间可按照碱基互补配对原则形成杂交分子如果将杂交分子中的一条单链连上标记物就成了核酸探针标记可以是同位素标记或非同位素标记MRNA的检测RNA印迹（ NORTHERN BLOT）用DNA探针来检测特异基因的mRNA，以分析该基因的表达情况及mRNA分子的大小，特别用于分析细胞生长、分化、发育过程中有关基因的表达。http:/ （REAL TIME RT-PCR）Real time PCR是一种定量PCR技术，用于定量测定特定基因的起始模板
10、数。当模板为来自mRNA反转录的产物cDNA时，可用于定量测定mRNA的模板数，从而确定特定基因的表达水平蛋白质的检测WESTERN BLOT这是一种利用特异抗体来鉴定相应蛋白质的技术蛋白质首先经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维素薄膜上，用带标记的抗体进行结合鉴定抗体标记可以是同位素标记或非同位素标记常用的非同位素标记物为辣根过氧化酶http:/Western-blot蛋白质的定量ELISA酶联免疫吸附法（ELISA）是利用了抗原抗体特异识别与结合的特性而设计的蛋白质定量测定方法，可用于测定蛋白质混合液中特定蛋白质的浓度，是常用的蛋白质测定方法。http:/ situ hybr
11、idization of TRPM8 mRNA to a prostate adenocarcinoma. 4 m sections were hybridized with the TRPM8 probe used in Northern and dot blot experiments. A) and B) hybridization of the antisense TRPM8 probe to an adenocarcinoma of the prostate. C) sense probe of TRPM8 and D) Haematoxilin and Elaun staining of the same patient. 免疫组化技术应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过标记抗体与组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的结合，可对蛋白进行定位、定性及定量的研究。FACTOR IX 在巨核细胞中的表达荧光显微技术FACTOR IX 的荧光检测2bF9-HFIXnullGHIJKLhFIXBright fieldOverlay
