高春-生化药物常用分析方法

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1、 生化药物常用分析方法北京市药品检验所生化生检室 高春1.生化药物概念2.生化药物的分类3.蛋白质的含量测定4.电泳法5. 酶的测定1生化药物的概念v生化药物是运用生物化学的研究成果，把 生物体产生的各种基本物质用于预防、诊 断和治疗疾病的一大类药物。包括从动物 、植物、微生物等生物体中提取分离的天 然物质及部分化学合成产物。通常所说的 生化药物是专指在生物体内起重要生理作 用的生命基本物质。如：氨基酸、多肽、 蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、维 生素、激素、糖与脂类等一大类药物。2. 生化药物的分类v(1) 按其来源分：生化药物按其来源 不同可分为植物生化药物、动物生化 药物、微生物生化药

2、物及合成生化药 物。v(2) 按其化学性质及作用分：可分为 氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降 解物、酶与辅酶、激素、维生素、糖 、脂、有机酸等。3. 蛋白质的含量测定v3.1 氨基酸及蛋白质的显色反应 v3.2 凯氏定氮法v3.3 福林-酚试剂法v3.4 双缩脲法v3.5 紫外吸收法v3.1氨基酸及蛋白质的显色反应 v3.1.1 茚三酮反应 v3.1.2 双缩脲反应 v3.1.3 与酚试剂的反应v3.1.1 茚三酮反应：蛋白质在pH57之间 ，与茚三酮丙酮溶液加热煮沸时即出现蓝 紫色。此反应用于蛋白质的定性与定量。 此反应的灵敏度为1g。凡具有氨基、能 放出氨的化和物几乎都有此反应，故可用 于

3、多肽与蛋白质及氨基酸的定性与定量分 析。v3.1.2 双缩脲反应 ： 蛋白质溶液加入氢氧 化钠溶液后，逐滴加入0.5%硫酸铜溶液 ，则出现紫色或紫红色。v原理 当脲（尿素）加热（约180），两 分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲 ，然后在碱性溶液中与铜离子结合生成复 杂的紫红色化合物。蛋白质或二肽以上的 多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似 的肽键，因此也有双缩脲反应。肽键越多 反应颜色越深。氨基酸无此反应。v3.1.3 与酚试剂的反应：蛋白质分子中 的酪氨酸、色氨酸 能与含有磷钨酸磷 鉬酸化合物的酚试剂起反应。在碱性条 件下后者被还原成蓝色物质。颜色的深 浅与蛋白质的量成正比，所以可作为蛋

4、 白质的比色测定方法。v3.2凯氏定氮法v3.2.1 原理v3.2.2 试剂和仪器v3.2.3 操作步骤v3.2.4 注意事项v3.2凯氏定氮法v3.2.1 原理每一种蛋白质都有其恒定的含氮量一般为15 17.6%，平均为16，因此只要测得样品中的含 氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量 。定氮法的基本原理是将蛋白质用浓硫酸分解， 并使其中的氮变成铵盐状态，再与浓碱作用， 放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，计算出含 氮量。微量凯氏定氮法最低可测出0.05毫克氮， 相当于0.3毫克左右蛋白质。蛋白质含量蛋白质含氮量100/16蛋白质含氮量6.25v3.2.2. 试剂和仪器v1微量定氮仪器装置全

5、套：包括蒸汽发生器、冷凝蒸汽 收集器、微量定氮蒸馏瓶、小型冷凝管。v2消化炉（电炉）v3浓硫酸v4. 氢氧化钠溶液（40%）v5消化剂：硫酸铜及硫酸钾按1:4（w/w）至1：5比例， 研细充分混匀。v6标准0.010N盐酸和0.010N氢氧化钠溶液。v7指示剂0.1%甲基红乙醇溶液。v82硼酸吸收液3.2.3 凯氏定氮法一般步骤消化消化蒸馏滴定返回v3.2.4.注意事项v1必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气 。v2消化初期瓶内物质碳化变黑，并产生泡沫，要特别注 意控制火力，微火加热，不能让黑色物质上升到颈部，否 则将严重影响样品的测定结果。当混合液停止冒泡，气体 逸出也较均匀时，可

6、适当加大火焰，使瓶内液体微沸而不 致跳荡。硫酸溶液逐步从棕黑色变成澄清。由于消化液澄 清并不说明消化一定完成，为保证反应充分完成，继续沸 腾1小时。反应终了，溶液应呈淡蓝色或无色透明，若带 有黄色表示消化末完全。如果蛋白质样品中含赖氨酸或组 氨酸较多，则消化时间要延长1-2倍。v3消化完毕，静置使冷，仔细加入少量 蒸馏水，洗涤管壁。因实验室中空气往往 含有极微量的氨，每次分析时都要另做空 白对照，即一切处理与样品管相同，但不 加蛋白质样品。v4蒸馏前要先蒸洗15分钟以上。v5小心加样，避免样品污染凯氏瓶口部 和颈部。v6使用凯氏定氮仪时，开关甲、乙的掌 握与实验成败很有关系，在加样时，开关 甲

7、一定要开启着，而且一定要使蒸汽发生 后才能关闭，否则会发生样品倒吸现象。 开关乙也要关闭及时，防止氨逸出。v7蒸馏时，保持火力稳定，否则易发生 倒吸现象。v8氨气蒸馏时，为了使所有硫酸铵分解 为氨，必须加入足量40%氢氧化钠，加入 时要水平缓慢，以免产生剧烈反应而导致 瓶内酸液倒吸和氨的损失，碱加入后，有 铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生 成，溶液呈蓝色或褐色。并有胶状沉淀产 生，这是正常现象，反之，如果不变，说 明碱液可能不够。v9如果测定的不是纯蛋白质，可能含有 非蛋白氮，必须分别测定蛋白氮和非蛋白 氮。非蛋白氮的测定可以将样品制成均浆 或抽提液，用三氯醋酸或钨酸等沉淀剂将 蛋白质沉淀

8、出来，按总氮法测定上清液的 含氮量，便得到非蛋白质氮。v3.3 福林-酚试剂法v3.3.1 原理v3.3.2 试剂v3.3.3 操作步骤v3.3.4 注意事项v3.3 福林-酚试剂法v3.3.1.原理：v福林-酚试剂法是测定蛋白质浓度应用最广 泛的一种方法。v福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的 显色原理包括两步反应：第一步是在碱性 条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复 合物；第二步是蛋白质铜复合物还原磷 鉬酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一 定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比 例。本法的优点是操作简便，灵敏度高。缺点 是有蛋白质特异性的影响，即不同蛋白质 的显色强度稍有不

9、同；标准曲线也不是严 格的直线形式。v本法的可测定范围是每毫升25-250微克蛋 白质。 v3.3.2.试剂v试剂A：（1）4碳酸钠溶液；（2） 0.2mol/L氢氧化钠溶液；（3）1硫酸铜 溶液（4）2酒石酸钾钠溶液（或其钾盐 或钠盐）。临用前将（1）与（2）等体积 混合，（3）与（4）等体积混合，然后这 两种试剂按50：1的比例混合，即成福林 酚试剂A。v试剂B：在1.5升容积的磨口流瓶中加入100克钨 酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫 升85%磷酸，100毫升浓盐酸充分混和，接上回 流冷凝管小火流10小时。回流结束后，加入150 克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口

10、继 续沸腾15分钟以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈 黄色，（如仍呈绿色，左须再重复滴加液体溴 的步骤）稀至1升，过滤，过滤置于棕色试剂瓶 中保存。使用时用标准氢氧化钠滴定，以酚酞为 指示剂，然后适当稀释（约加水1倍）使最终的 酸浓度为1mol/L。v3.3.3 操作步骤v（1） 1ml待测样品溶液（适当稀至约含 25-250微克蛋白质），加5ml试剂A混合， 室温下放置10分钟后加0.5ml试剂B，立即 混和均匀，30分钟后，以不含蛋白质试剂 空白对照比色。可选用波长650nm或 660nm。v（2）标准曲线制备：v 在各试管中分别加牛血清白蛋白溶液（ 250微克/毫升）0、0.2、0.4、0.

11、6、0.8和 1.0毫升，并分别加蒸馏水补充到1毫升（ 即各管中分别含蛋白质量0、50、100、 150、200和250微克）。以后加试剂及比 色等操作步骤与样品操作相同。v3.3.4.注意事项v(1)牛血清白蛋白的含量明确。v(2)福林酚试剂B在酸性条件下比较稳定 ，而福林酚试剂A在碱性条件下与蛋白质 作用生成碱性的铜蛋白质溶液。所以加 入福林酚试剂B这一步混和速度要快，使 还原反应产生在磷鉬酸磷钨酸试剂被破 坏之前，否则会使显色程度减弱 。v(3)反应时间及反应温度严格控制。v(4)按照化学实验的要求精密操作。v3.4 双缩脲法v3.4.1 原理v3.4.2 试剂v3.4.3 操作步骤v3

12、.4.4 注意事项v3.4.双缩脲法v3.4.1原理v双缩脲（NH2CONHCONH2）是两分子脲 经180左右加热，放出一分子氨后所得 到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色，称为双缩脲反应。凡具 有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或 通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化 合物都有双缩脲反应。v双缩脲法是测定蛋白质浓度常用方法 之一，它除了操作简便、迅速外，最 大的优点是受蛋白质的特异性影响较 小，但灵敏度差，所需样品量大。利 用铜复合物有紫外吸收的特性，使双 缩脲方法能在数十微克水平进行测定 。v3.4.2试剂v碱性铜试剂 0.175克硫酸铜溶解于约15毫 升水中，置于一1

13、00毫升容量瓶中，加入 30毫升浓氨水，30毫升冷的蒸馏水及20毫 升饱和氢氧化钠溶液，混匀后，放置至使 溶液温度与室温相同，以蒸馏水稀释至刻 度，摇匀。此试剂在室温下可以放置3-4个 月不影响显色。v3.4.3操作步骤v(1)标准曲线制备 每组取7支试管，依次加 入蛋白质标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0ml，分别补足蒸馏水至3毫升，混 匀后各管加2毫升碱性铜试剂，充分混和后 ，呈现紫色，立即于540nm下测定光吸收（ 以第一管作空白对照）。v(2)供试品测定 取3毫升样品溶液，加入碱 性铜试剂2毫升，充分混匀后，于540nm下 测定吸收值，操作条件同标准曲线。v3

14、.4.4.注意事项v样品溶液与试剂混合后，有时约30分钟后 有雾状沉淀 产生。这种现象对含脂肪类物 质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋 白质溶液不明显。克服的方法有三种：（1 ）加入试剂后立即比色，至少应在30分钟 内完成；（2）如沉淀已经产生，则可以放 置二小时或更多时间，离心去沉淀后取上 清液比色；（3）加1.5毫升乙醇或石油醚 ，离心后比色。 v3.5 紫外吸收法v原理蛋白质分子中所含有的酪氨酸和色氨酸残 基使蛋白质在280nm下具有最大吸收值； 蛋白质溶液在238nm下的光吸收值，其吸 收强度与肽键量成正比。利用在一定波长 范围内吸收值与蛋白质浓度成正比关系可 以进行蛋白质含量的测定

15、。4.电泳分析法v4.1 电泳的基本概念v4.2 电泳的分类v4.3 醋酸纤维膜电泳法v4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳v4.1 电泳的基本概念v电泳：带电颗粒在电场作用下向着与其电 性相反的电极移动，称为电泳。v4.2. 电泳的分类v按分离原理分类可分为区带电泳、移界电 泳、等速电泳和聚焦电泳4种。v（1） 区带电泳 电泳过程中，不同的离子 成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的 区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。v（2） 移界电泳 是在U形管中进行的，由 于分离效果较差，已为其他电泳技术所取 代。v（3 ） 等速电泳 需专用电泳仪，当电泳达 到平衡后，各区带相随分成清晰的界面， 并以等速

16、移动。v （4 ）等电聚焦电泳 由于具有不同等电 点的两性电解质载体在电场中，自动形成 pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的 pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。 从表面上看与区带电泳相似，但原理不同 。v4.3.醋酸纤维膜电泳法v4.3.1 基本概念 什么是醋酸纤维膜电泳 以醋酸 纤维膜为支持介质的一种区带电泳技术。v4.3.2 原理 蛋白质是两性物质，具有两性游离 特性。人血白蛋白为一种蛋白质，因而其具有两 性化合物的性质，在碱性缓冲液中，即pH质大 于等电点时，蛋白质分子带负电荷，在电场中向 正极迁移，如果人血白蛋白中含有其他杂蛋白， 其带电荷的量会不同于人血白蛋白，在电场中迁 移的速度就不同，带负电荷越多的蛋白质其迁移 速度越快。这样就会在醋酸纤维薄膜留下不同的 区带，经染色后，脱色，扫