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1、DNA的粗提取与鉴定 海安李堡中学 张云无论是果胶酶还是加酶洗衣粉中的酶 制剂,都是从细胞中提取出来的。从 今天开始,我们学习生物化学成分的 提取与改造技术。基础知识: DNA粗提取的原理 提取DNA的溶解性原理包括哪些方面?提取DNA的原理包括DNA的溶解性和耐 受性两个方面。 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同 ;DNA不溶于酒精。思考1分析图51。DNA在不同浓度 NaCl溶液中溶解度有何特点?要使DNA溶 解,需要使用什么浓度?要使DNA析出, 又需要使用什么浓度?在0.14mol/L时溶解度最小;较高浓度可使 DNA溶解;0.14mol/L可使DNA析出。 思考2 在溶解细胞中
2、的DNA时,人们通 常选用2mol/LNaCl溶液;将DNA分子析出 的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注 入蒸馏水,以稀释NaCl溶液。酒精是一种 常用有机溶剂,但DNA却不能溶于酒精( 特别是95冷却酒精),但细胞中蛋白质 可溶于酒精。问:采用DNA不溶于酒精的 原理,可以达到什么目的?将DNA和蛋白质进一步分离思考3 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温 和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时,应选用 怎样的酶和怎样的温度值?蛋白酶,因为酶具有专一性,蛋白酶只水解蛋白质 而不会对DNA产生影响。温度值为6080,因 为该温度值蛋白质变性沉淀,而DNA不会变性。补充:DNA的变性是指DN
3、A分子在高温下解螺旋 ,其温度在80以上,如在PCR技术中DNA变性 温度在95。 DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要 使用什么指示剂进行鉴定? 在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺呈现蓝色原理总结。通过利用不同浓度NaCl溶液溶 解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯 DNA;再利用酒精进一步将DNA与蛋白质 分离开来,达到提纯的目的;最后利用二 苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 1实验材料 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取 材料时,应本着DNA含量高、材料易得、 便于提取的原则。你认为教材提供的材料 中哪些不适合提取DNA? 从核DNA数目来看,猪38条,鸡78条,
4、哺 乳动物血0条,猕猴桃58条,洋葱16条,豌 豆14条,菠菜12条,大肠杆菌1条。请选择 动植物材料各一种。哺乳动物的血液和液体培养基中的大肠杆菌。鸡血、猕猴桃。 2 破碎细胞,获取含DNA的滤液 若选用鸡血和洋葱作实验材料,则怎样获 取含DNA的滤液? 在以上实验中,加入蒸馏水、洗涤剂和食 盐的作用分别是什么?过滤时应当选用( 滤纸、尼龙布)。在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅 拌,过滤后收集滤液;切碎洋葱,加入一定量 洗涤剂和食盐,搅拌研磨,过滤后收集滤液。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂;洗涤剂瓦 解细胞膜;食盐溶解DNA物质;选用尼龙布进 行过滤。 在处理植物组织时需要进行研磨,
5、其目的 是什么?研磨不充分产生什么结果? 具体做法。10mL鸡血20mL蒸馏水同 方向搅拌3层尼龙布过滤滤液破碎细胞壁,使核物质容易溶解在NaCl 溶液中;研磨不充分会使DNA的提取量 减少 3 去除滤液中的杂质 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等 杂质,需要进一步提纯DNA。阅读教材提 供的三种方法,分析其中的原理。 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液 中溶解度不同; 方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分 解DNA; 方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度 不同。 具体做法。 方案一:30mL滤液35gNaCl同方向搅 拌,DNA溶解加入蒸馏水DNA析出 过滤得到过滤物放到2mo
6、l/LNaCl溶液中 溶解DNA-NaCl溶解液 方案二:30mL滤液嫩肉粉(木瓜蛋白酶 )静置1015分钟DNA滤液 方案三:30滤液6067处理过滤获 得DNA滤液 4 DNA析出与鉴定 在滤液中仍然含有一些杂质,怎样除去这 些杂质呢?得到的DNA呈何颜色? 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀,静置2 3分钟,析出的白色丝状物就是DNA。 DNA呈白色。 怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢? 阅读教材。 阅读。简述DNA的鉴定过程。 具体做法。试管2支,编号甲乙各加等量 5mLNaCl溶液甲中放入少量白色丝状物 ,使之溶解各加4mL二苯胺,混合均匀 沸水浴5min观察颜色变化 3实验操作 制
7、备鸡血细胞液加柠檬酸钠,静 置或离心 破碎细胞,释放DNA 加蒸馏水,同一方 向快速通方向搅拌 过滤,除去细胞壁、细胞膜等。 溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L ,同一方向缓慢搅拌 DNA析出 加蒸馏水至 0.14mol/L,过滤,在溶解到2mol/L溶液中 除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化 与等体积95冷却 酒精混合,析出白色丝状物 除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定 二苯胺,沸水浴, 呈现蓝色 其它注意事项: 在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静 置或离心以提高细胞悬液浓度;使用塑料 烧杯;使用尼龙布过滤;玻棒沿同一方向 搅拌;玻棒搅拌要缓慢(细胞破裂快速搅 拌);玻棒不要碰到烧杯壁;二苯胺试剂 要现用现配等。为了提高DNA纯度,在科 学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三 甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠( SDS)。