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1、 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳（Electrophoresis on Electrophoresis on cellulose acetate cellulose acetate membrane of serum membrane of serum proteins)proteins)实验目的l1、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理l2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质 的实验操作技术和注意事项。l3、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳的优点及使用范围。电泳技术l电泳：溶液中带电粒子在直流电场向着电极相反 方向移动的现象称为电泳（electrophoresis） 。l电泳技术是利用带电粒子在电
2、场作用下定向移动 的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的 一项技术。电泳的分类l按分离目的：分析电泳和制备电泳l按电场强度：常压电泳和高压电泳l按电泳媒介：自由电泳和区带电泳区带电泳（按支持介质）：淀粉凝胶电泳 滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳按支持介质形式：水平式电泳、垂直电泳l按缓冲液pH值：连续pH和不连续pH电泳临床电泳项目l临床上以琼脂糖电泳法开展的电泳项目：血清蛋白电泳免疫固定电泳尿蛋白电泳同工酶电泳脑脊液寡克隆电泳本周氏蛋白电泳脂蛋白电泳醋酸纤维素薄膜电泳采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方 法叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所
3、形成 的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮 、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀 的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具 有均一的泡沫状结构，厚度约为120m，通透 性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支 持物。醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用l具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度 高、便于摄影和保存等优点。l用于科学实验、生化产品分析和临床化验， 如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、 糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。原 理血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都 低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各 种蛋白质分子大小
4、、形状及所带的电荷量不同 ，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同 。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、 1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。血浆蛋白质的等电点、 平均相对分子量、及正常含量球 蛋 白 清蛋白A1 2 pI相对分子量 （104）含量（% ）4.886.957725.0620255.0630495.129156.2126.857.315.6301220实验材料l健康人血清或动物血清试剂l1、pH8.6巴比妥缓冲液l2、氨基黑10B染色液l3、漂洗液l4、洗脱液l5、透明液 （试剂配制参见实验讲义）定量时用仪器和器材l1、常压电泳仪、电泳槽l2、醋酸纤维
5、素薄膜（28cm）l3、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板l4、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）l5、滤纸l6、镊子l7、试管、试管架、吸量管l8、分光光度计（定量用）操作步骤l1、薄膜准备将醋酸纤维素薄膜切成28cm的小条。在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线 。在薄膜角上用铅笔作一标记。将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。操作步骤醋酸纤维素薄膜规格及点样位置8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）点样线点样线尽量点得细窄而均匀尽量点得细窄而均匀, ,宁少勿多宁少勿多, , 用铅笔做好标记（组号以及蛋白名称）用铅笔做好标记（组号以及蛋白名称）操作步骤l2、电泳仪准备在电泳槽内加入缓
6、冲液，使两个电极槽 内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条， 取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它 的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电 极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿 并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤 纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液 之间的“桥梁”。 操作步骤操作步骤l l3 3、点样（电泳的关键步骤）、点样（电泳的关键步骤）用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两 层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在 玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养 皿的血清中沾一下，再
7、在膜条点样线处皿的血清中沾一下，再在膜条点样线处轻轻轻轻 地水平落下并随即提起地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点，这样即在膜条上点 上了细条状的血清样品。上了细条状的血清样品。 点样线点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多尽量点得细窄而均匀。宁少勿多 。操作步骤l4、上槽待血清吸入膜后，以薄膜粗面向下、点 样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜膜 应轻轻拉平应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗 透的缓冲液达到平衡。切勿使点样处与电泳槽接触醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图操作步骤l5、电泳检查电泳装置是否正确，开启电源，调 节电压、电流，然后通电4060min。电压：110130V（10V/c
8、m膜长）薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间 滤纸盐桥和薄膜的长度之和。电流：0.40.6mA/cm膜宽 有数条膜便求数条膜宽的总和。操作步骤l6、染色和漂洗电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直 接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液 中浸洗脱色（一般更换23次），至背景颜 色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。操作步骤l血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱电泳方向A12血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果操作步骤l7、透明薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min 后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡） ，完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫 描或照相用。可长期保存。操作步骤操作步骤l l8
9、8、定量（略）、定量（略） 洗脱比色法洗脱比色法 光密度计扫描法光密度计扫描法血清蛋白电泳血清蛋白电泳 光密度扫描光密度扫描临床意义l1、M蛋白（异常免疫球蛋白）血症： 在-球蛋白区、 -球蛋白区或两者之间，出现区带细而浓，有时呈波 浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰的M蛋白带。l2、蛋白质缺乏症l3、肾病l4、急慢性炎症l5、肝病：肝硬化出现“-桥”原发性肝癌在Alb与1-球蛋白之间出现一小的区带 ，称为甲胎蛋白带。几种疾病的蛋白电泳变化病名病名 AlbAlb 1 1 2 2 肾病肾病 肝硬化肝硬化 原发性肝癌原发性肝癌 多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤 慢性炎症慢性炎症 无丙种球蛋白症无丙种球蛋白
10、症 双白蛋白血症双白蛋白血症 AFPAFP - - 桥桥 操作流程1、薄膜准备 2、电泳仪准备 3、点样 4、上槽 5、电泳 6、染色及漂洗注意事项l1、最好选用同一批号、厚薄均匀、质量良好 的醋纤膜。l2、样品要新鲜。l3、点样要细窄、均匀、集中。l4、盐桥要平整。l5、电泳槽盖要密封。l6、室温不宜过高。注意事项l7、选择合适的缓冲液离子强度。l8、两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面。l9、要控制好电压、电流和电泳时间。l10、电泳槽内两极溶液要交替使用，操作时 应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及 离子强度的改变，防止霉菌的滋长。思考题l l1 1、以醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？、以醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？l l2 2、简述肾病综合征、慢性肝炎及肝硬化患者的血清、简述肾病综合征、慢性肝炎及肝硬化患者的血清 蛋白电泳结果可能出现怎样的改变？蛋白电泳结果可能出现怎样的改变？
