微生物基因重组

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1、Genome shuffling 李宏思 2100659 韩建帅 2100667目 录一、基因重组技术的历史二、定义及原理三、主要步骤六、存在的问题及展望四、特点及其应用五、两面性Company Logo一、基因重组技术的历史进入21世纪,面对石化资源 、能源危机和环境危机日益加 剧,以可再生生物资源为原料 的生物技术产业展现出前所未 有的竞争力,推动了工业菌株 育种技术的发展。传统育种技 术工程量巨大,耗时长,且难 于获取复杂表型。近十几年里 ,工业菌株改造主要集中在代 谢工程。该技术主要是运用现代基因手 段,对微生物进行定向基因操 作。虽然代谢工程育种较传统 育种取得了一定成果,但是基 因

2、型和表型相应背景的欠缺会 限制其更广范围的利用。基因 组重排技术是一种典型的全面 组合技术手段,是全基因组代 谢工程的延伸。一、基因重组技术的历史该方法由Stemmer在 1994年提出的。DNA shuffling该方法是由Stemmer在1998年提出的。Genome shuffling该方法是2002年由Zhang等在Nature上发表文章首次提出的。基因组重排技术结合传统育种技术将同源的DNA用DaseI进行消化成片段,然后将得到的随机片 段无引物PCR,使之重新随机装配,从而获得了多种排列组合 的突变基因库,最后利用设计好的引物PCR,得到预期的重组 体。该方法是通过传统诱变与原生质

3、体融合 技术相结合,对微生物细胞进行基因组重 排,从而大幅度提高微生物细胞的正向突 变频率及正向突变速度,使人们能够快速 选育出高效的正向突变菌株。通过多亲本之间的DNA重 组和全基因组片段交换, 将优良表型重组在一起的 过程。二、定义及原理定义基因重组基因重组技术Please write down of contents explanation for Business Area.是指由于不同DNA链的断裂和连 接而产生的DNA片段的交换和重 新组合,形成新的DNA分子的过 程。就是人类按照自身的需要和 意愿,用类似工程设计的方式, 将DNA在体外或体内进行组合, 然后把组合后的DNA有目的

4、的通 过基因克隆、基因表达等方式形 成人们所需要的新生物种或类型二、定义及原理定义微生物n基因重组微生物目前 尚无权威性概念。专 家于2007年1月在经充 分讨论后认为;是指运用遗传学、基因工程和 分子生物学技术,人工合成或 对某种微生物的基因进行操作 和修饰,并能表达、存活,从 而使原有微生物的性状、功能 等发生变化,而产生的新的生 物体。基因重组二、定义及原理原理Genome shuffling是一项对整个微生物全基因组 进行重排的定向育种技术,它把传统微生物诱变育 种技术与细胞融合技术结合,通过诱变手段获得若 干正性突变株,并采用细胞融合方式使之全基因组 发生重组,经过递推式多次融合,使

5、基因组在较大 范围内发生交换和重排,将引起正性突变的不同基 因重组到同一个细胞株中,最终获得具有多重正向 进化标记的目标菌株。三、主要步骤不同亲本原生质体的选择与制备一、诱导原生质体递归融合,每轮筛选 的目的菌进入下轮融合二、根据目的表型需要设计特殊的选择培 养基,每轮筛选的融合菌株,进入下 轮的融合三、三、主要步骤一 . 亲本菌株的选择 亲本菌株基因的多样性可以扩大融合菌的基因型,在递归融合中促使不同优良表型汇集到融合菌中故基因组重排技术过程的首要任务是创造亲本基因型的多样性。一般手段是传统诱变育种技术,使菌株产生更多的基因型。作为筛选亲本菌株的一般准则是亲本菌株必须具有理想的目的表型,如具

6、备特殊环境高耐受力,产物高产率和菌株高生长率。、三、主要步骤二. 原生质体递归融合 基因组重排技术是基于原生质体融合技术之上的多轮递归融合。多轮递归融合确保了不同细胞之间的基因高转移频率,还保持了基因组重排的高效性。在原生质体递归融合过程中,首先要制备原生质体。制备原生质体主要参考的因素有菌龄、酶解浓度、酶解时间及温度、酶的种类、脱壁辅助溶剂的选择和渗透压缓冲剂及再生培养基的设计等。递归融合的要义在于进行第一轮融合后筛选的融合菌株作为出发菌株,必须进入下轮融合。三、主要步骤 目前,诱导原生质体融合的方式主要有生物病毒法,化学法和电处理融合法。化学法和电处理融合法是当前最主要的方法。三、主要步骤

7、 随着科学技术的不断发展,一些新的工具开始运用于诱导细胞融合。Gong等用激光诱导红发夫酵母进行细胞融合。Skelley等运用微流体芯片技术作为诱导细胞融合的技术平台,明显提高了融合效率。三、主要步骤三.融合子的筛选 目的融合菌的筛选与分离是整个基因组重排技术流程最为关键的步骤。基因组重排技术提高菌株对环境耐受性,可以方便设计含有高浓度的底物或产物的选择培养基。三、主要步骤 对于一些产酶的菌株可以采用较为直观的方法,如水解圈法、灿烂绿法、琼脂平板法等进行初筛,再对初筛获得的优良菌株进行较精细的复筛。其中复筛可能会进行几次,例如二次或三次复筛;并且每次复筛的方法都可能根据实验的不同而有所不一样。

8、三、主要步骤 对于其它菌株可以采用对某些条件的耐受性进行筛选,但对于一些生产周期长的产胞内次级代谢产物的菌株,仍没有有效的筛选方法。目前已经开发了一些应用于DNA改组的高通量筛选方法,如:荧光激活细胞分类法, 96孔板结合微板分光光度计进行高通量筛选。三、主要步骤四、特点及其应用 基因组重排技术充分结合了细胞工程和代谢工程的优势,不仅可以进行菌种表型快速高效优化,还可为不同种类的微生物复杂的代谢和调控网络提供了信息来源。四、特点及其应用基因重组技术的特点能提高子代 菌株的遗传 多样性该技术简单 实用,容易 推广.无需菌种背 景知识比传统诱变选 育更快速有效 四、特点及其应用(1)比传统诱变选育

9、更快速有效 传统诱变通常是将每一轮产生的突变体库中筛选出的最优的1株菌作为下一轮诱变的出发菌株,而Genomeshuf-fling则是将一次诱变获得的若干正性突变株共同作为出发菌株,经过递推式的多轮融合实现较大范围内的基因重组,效率更快更高,并可以基本避免诱变选育中因多次诱变导致的“钝化”反应和“饱和现象”,在一定程度上克服了诱变选育存在的缺点 四、特点及其应用(2)能提高子代菌株的遗传多样性 基因组改组技术源于原生质体融合技术,但两者最大区别在于基因组改组技术使用多亲本,而非双亲本,并且进行多轮递推式融合,能产生各种各样的突变组合,这将大大增加子代筛选群体内遗传多样性,从而提高了获得优良性状

10、的菌株的几率。四、特点及其应用(3 )该技术简单实用,容易推广。应用该技术对设备要求不高,费用较低(一轮基因组改组的费用略相当于一轮理化诱变的费用),同时该技术易于实施,不需要对工业微生物基因的结构和功能作详细了解,也不需要以工业微生物的代谢路线图及其代谢调控机制等理论作基础,因此,普通的育种工作人员在一般实验室条件下就可以运用该技术开展相关实验,容易广泛推广。四、特点及其应用(4)无须对须对 菌种遗传遗传 背景十分清楚,有效 地对对由“多基因”调调控的性状进进行改良。Genome shuffling技术在工业微生物菌种选育中的应用四、特点及其应用1 Genome shuffling技术改组细

11、菌在乳酸发酵生产中,乳酸菌同时具有底物抑制和 产物抑制的发酵特征,因此通过提高乳酸菌的耐 糖性和耐酸性,进而提高乳酸产量是乳酸生产中 的一个重要研究方向实例:于雷等对鼠李糖乳杆菌MEE539进行2轮基因 组改组,获得1株改组菌株F2-2,在含15%葡萄糖的 YE培养基中摇瓶发酵36h产酸能达到135.6g/L,表 明该改组菌在高糖条件下仍能有较高的产酸量,表 现出很好的葡萄糖耐受性。1 Genome shuffling技术改组细菌梁惠仪等从豆豉里面筛选得到1株具有纤溶酶活 性的枯草芽孢杆菌DC-12,进行2轮基因组改组 。从第1轮改组菌株中获得6株正突变株,与原始 菌株DC-12一起作为亲本,

12、进行第2轮改组筛选 获得5株酶活在1600U/mL以上(最高酶活 2600U/mL)的正突变株,较亲本菌株提高了45 倍。表明在基因组改组过程中,结合原始菌株 进行下一轮改组能获得很好的效果。2 Genome shuffling技术改组放线菌朱惠等在改组纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌SG-1的 过程中,对常规的改组技术操作路线作了改进。将 第1轮shuffling再生菌落(包括融合体和亲本)不 经过筛选,而直接用于制备原生质体后进行下一轮 shuffling。最终仍筛选得到14株高产改组菌株,其 中1株S.gilvosporeus GS-74的纳他霉素产量为 3574mg/L,是产量最高的亲本菌株

13、的1.5倍,比原 始出发菌株SG-1提高1.17倍。改进后的技术路线既 高效可行,又节省了时间和工作量,值得推广。2.3 Genome shuffling技术改组酵母菌 最近的研究表明,酵母菌耐高温和耐酒精的生化机 理十分复杂,涉及到大量的基因产物及其相关的代 谢途径因此用基因工程等正性育种手段,很难同时 提高酵母菌的耐高温和耐乙醇性能。 王灏等以3株酿酒酵母菌f4、f5、f6作为出发菌株, 分别进行原生质体紫外诱变,通过在不同温度含不 同乙醇浓度的一系列平板筛选,获得耐高温或耐乙 醇性状有较大提高的7株正突变菌株。以这些菌株 作为出发菌株,进一步用硫酸二乙酯诱变,获得了 2株乙醇耐受性能较高

14、的菌株。以上述9株优势菌为 出发菌株,进行2轮shuffling。.3 Genome shuffling技术改组酵母菌 筛选获得14株耐高温和耐乙醇浓度都较出发菌株有 了较大提高的菌株,期摇瓶发酵过程中发酵液中的 最高乙醇浓度为12.93%vol,比原始出发菌株f4( 35的发酵液中最高乙醇浓度8.11%vol)提高了约 5%vol,证明通过Genome shuffling的方法能将酵 母菌耐高温和耐高乙醇的性能集中于同一菌株,从 而选育出既耐受较高温度又耐受较高乙醇的菌株。 该思路对于采用基因组改组技术选育同时具有多种 性状的优良菌株有指导意义,具有潜在的应用价值 。.4 Genome sh

15、uffling技术改组霉菌 酱油是深受人们喜爱的大宗调味品,其酿造涉及到 一个复合酶系,其中中性蛋白酶是主要的代表酶, 因而提高菌种的中性蛋白酶酶活对酱油酿造是很有 益的.李立风等对分离自曲精的曲霉BI进行2轮基因 组改组,从第1、2轮shuffling的F1和F2代融合株 中分别筛选到6株和7株酶活较高的菌株,分析发现 F2代菌株的平均酶活更高,不过酶活最高的菌株是 F1-103,表明在改组过程中,对于个体来说,优良 表型的获得有一定的不确定性,但是就整体而言, 基因组改组过程中正性突变的累计效应是很明显的 。 。.4 Genome shuffling技术改组霉菌 同时,该技术路线在原生质体

16、灭活和融合等各个环 节均体现出随机性,以增加基因组交换和重组的机 率,无形中增大了获得优良菌株的概率,结果表明 这种思路是可行的。五、两 面 性五、两 面 性贡 献医药产业农 业工 业环境保护能源开发21世纪人类进入知识经济时代,随着医学科学、生物 技术、药学科学的发展,世界医药界将发生新的转变 ,医疗模式将由治疗为主向预防为主转化,制药将由 以化学药为主向生物技术药物和天然产物综合利用开 发转变,以生物技术开发未来药物已成为制药企业新 药开发的重要手段。增长最快的为基因重组药物,疫 苗居第2位,治疗范围包括肿瘤、类风湿关节炎等。从 生物技术药物制备及使用分析看,具有环境污染少、 不受资源限制、临床使用毒副作用低等特点,显示了 强大的生命力,将成为21世纪药物市场重要的组成部 分。1.医药产业2.农业植物 转基因技术开辟了植物改良的新时代。自1983年人 类首次获得转基因烟草和马铃薯以来,转基因动、植物研

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