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1、基因工程技术 (Genetic engineering)生化分生系 段秋红2. 基因工程（genetic engineering）：在分 子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割 ，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重 组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细 胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的 蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳 定的遗传给子代。一、基本概念1. 基因（gene）：是生物体传递遗传信息和表 达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功 能的蛋白质或RNA所必需的全部核苷酸序列。生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的： 分离
2、获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。l分：目的基因的获取、载体的选择l切：限制性内切酶的应用l接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体l转：将重组体导入到受体细胞l筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆l表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物二、基因工程的基本程序：分、切、接、转、筛、表G CCTAG G CCTAGG CCTAG G CCTAG分分切切接接转转筛筛 表三、基因工程实验特点及要求l1. 微量操作 l 2. 连续性操作 l 3.
3、 低温操作 l 4. 防止污染（杂质污染、细菌污染）l 5. 实验物品切忌乱扔乱丢 l 6. 认真写好实验纪录l第一次实验: 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析l第二次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接l第三次实验：重组质粒的转化、Southern杂交演示l第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备）l第五次实验：RT-PCR、考试实验一 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析l目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。 为酶切和基因转染作准备。质粒 （plasmid）：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主 细胞一些遗传性状。 基本步骤：l细菌的生长和
4、质粒的扩增: 将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。l细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒 ；l质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂染色体DNA 。碱变性抽提质粒DNA原理：l利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性 和复性的差异。l在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线 状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开 。当pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中， 而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相 互缠绕形成沉淀，经离心被分离。质粒DNA的纯化：l蛋白质的清除：蛋白质
5、的变性剂酚和氯仿.lRNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。l与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNA的清除：等体积1.6mol/L NaCl , 13%PEG; CsCl梯度超速离心等。CsCl密度梯度超速离心法：lCsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离 心后，形成浓度梯度，当DNA的沉降速度与扩散速度 达到平衡时，染色体DNA、质粒、RNA等各分离颗粒， 在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置 分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取 决于密度。EB是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNA的 碱基之间，使DNA的解旋体积增大，浮力密度变小。 EB与环状质粒DNA
6、的结合量小于线状染色体DNA的结合 量，故质粒DNA的浮力密度大与线状染色体DNA, 位于离心管的下层。RNA总是与Cs+结合，密度最大，超离 时位于管底。 Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）l利用分子筛效应，分子量大的分子不 能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙 先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒 DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA操作步骤:收集 细 菌溶菌酶GET破壁SD
7、SNaOH pH=12.6 碱变性KAc pH=4.8质粒DNA完全复性染色体DNA不能复性上清: 质粒,小分子RNA,少量蛋白质沉淀: 染色体DNA, 大分子RNA ,SDS蛋白质复合物取上清, 加等体积异丙醇 沉淀DNA(缩小体积)沉淀溶于5ml TE等体积LiCl2500rpm20m沉淀 5m冰上5m冰上10m2500rpm10m放置 510m2500rpm10m沉淀RNA冰上10m2500rpm10m等体积异丙醇加等体积酚 氯仿异戊醇去杂蛋白取上层水相酚氯仿异戊醇重复一次离心,取上 层水相2倍体积无水乙醇0.1体积NaAc沉淀DNA离心TE(30ul)溶 解沉淀取5ul电 泳鉴定沉淀溶
8、于 400ul TE放置10m2500rpm10m5ul RNA酶消化30min转入EP管1000rpm 2m20度20m12000rpm 5mDNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离l原理 以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同 ，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNA可与荧光染 料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带 。 DNA可与荧光染料Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色 荧光条带。 。l琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先 处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99），近似自 由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小
9、，电泳图谱清晰 ，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果 可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于 定量测定，制成干膜可长期保存。DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：l1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反 比，但当20kb时，迁移率不在依赖于分子大小；l2. 核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环 DNA直线DNA开环环状DNA l3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶 浓度中迁移率不同；l4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及 电压（ 2.0DNA:OD260nmOD280nm= 1.71.7, RNA污染15Kb的DNA片段和单链DNA不适合
10、，因难以洗脱下来。三、DNA片段回收及纯化l透析袋电洗脱法：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE电泳槽中，电泳2-3小时，使DNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的DNA，但很不方便。l从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在300C左右成胶，大约在650C熔化，在大多数双链DNA熔点温度以下。l采用挖槽法l酚冻法。纯化：l1.DEAESephacel柱层析法：将带负 电荷的DNA结合到一种阳离子基质上而 将污染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强度将DNA
11、 洗脱下来。l2.有机溶剂抽提法：用2-丁醇和酚 氯仿抽提。l制胶l点样l电泳分离l回收片段l抽提沉淀DNA。操作步骤:结果分析：l分子量标准：噬菌体的DNA，全长49.01kb ，经Hind消化产生7条带，23.7kb, 9.46kb, 6.75kb, 4.26kb, 2.26kb, 1.98kb, 0.58kbl完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体， 分别为1.1kb和5.4kb，应位于1.98 和0.58kb 及4.266.75kb之间l溴酚蓝前的绿色带为RNAl若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三 种构象。 开环线性超螺旋marker plasmidRE digested四、DN
12、A片段的重组连接l原理 1. 在T4DNA连接酶的催化下，载体基因片段与目的基因片段的粘性末端共价结合,连接,环 化成重组环状DNA分子。l2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头 器l3.影响重组连接因素:目的基因的浓度与载 体的比例(3-5:1)；离子浓度；温度：14- 160C。l4.DNA连接酶单位：用Weiss单位对酶进行标 化：1个Weiss单位指在370C下20分钟内催化 1nmol32Pi从焦磷酸根置换到,-32PiATP所需的酶量。（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应
13、GGATCCCCTAGGT4 DNA连接酶 15CGATCCGG CCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+ +EcoR+ Bg l 双酶切Eco R+ Bg l 双酶切T4 DNA连接酶 15C重组体配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶 15C重组体载体自连目的基因自连3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(termi
14、nal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5 33 5载体DNA5 33 5目的基因限制酶或机械剪切限制酶5 33553 T(T)nT T(T)nT3 55 33 553 A(A)nA A(A)nA 3 5-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶 + dATP末端转移酶 + dTTPT(T)nT A(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶 15C重组体4. 人工接头(linker)连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5- 3-Ec
15、o REco REco REco R连接体系l目的基因： 8ull载体质粒 2ull10xBuffer 1.5ullT4 DNA连接酶 1ull水 2.5ul总体积： 15ul第三次实验 感受态细菌的制备及转化实验l原理 l1.将重组DNA分子导入受体细菌中进行复制扩增 ，再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将 重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染 。一般受体细菌对重组DNA分子的摄取能力很低 ，难以转化成功。后来人们发现，用氯化钙处 理后的细菌细胞对DNA的摄取能力大为增加，转 化效率提高。这种细菌细胞能摄取外来DNA的生 理状态称为感受态，此阶段的细菌称感受态细 菌。l2.感受态形
16、成假说：局部原生质体假说：用特定的化学或物理因 素处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成 一些小孔，允许外来DNA分子进入。酶-受体假说：用特定的化学或物理因素处 理细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生 了一些酶的位点，可以把外来DNA转入胞内。l3.制备方法：l电击法:将细菌置入一定的容器内，通入 高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成 功效率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易 死亡，约一半以上的细胞死亡。l化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯 化六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。4.受体菌的改造与选择：l限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R ：restriction; M
