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1、第三章农业基因工程Date1第一节 基因工程的物质基础 第二节 基因工程操作程序 第三节 转基因植物与植物改良 第四节 转基因动物及应用Date2第一节 基因工程的物质基础一、基因工程的诞生 二、基因工程的含义 三、基因工程工具酶 四、基因工程载体 Date3一、基因工程的诞生理论基础：三大发现 20C40S，基因载体是DNA遗传物质基础问题； 20C50S，DNA双螺旋结构和半保留复 制基因的自我复制和传递问题； 20C50-60S，中心法则和操纵子学说遗传信息的流向和表达问题。Date4技术基础：三大发明 工具酶 载体 反转录酶Date5二、基因工程的含义 基因工程（gene engine
2、ering）指将某种生物的基因经过体外修 饰或直接导入另一种生物细胞或个体 ，从而改变生物的遗传性状或创造新 的生物类型。这种人为在遗传物质的分子水平 上改造和设计生物的结构和功能的生 物技术，就是所谓的基因工程，也称 DNA重组技术。 Date6基因工程的优势 生物技术的核心技术 基因交换不受生物物种亲缘关系的限 制。生物基因可在人、动物、植物和微 生物四大系统间进行交换，人类可以 构思并创造出世界上前所未有的生物 新类型。Date7三、基因工程工具酶 基因工程操作需要在分子水平上对 DNA分子进行剪接、重组和转运，需 要借助一些工具。 1、限制性内切酶 2、DNA连接酶 3、DNA聚合酶
3、4、反转录酶 Date81、限制性内切酶限制性内切酶就是一类能够识别双链 DNA分子中某种特定核苷酸序列，并 由此切割DNA双链结构的酶。 1970，Smith和Wilcox，Hind 1972，Boyer，EcoR 300种微生物500种限制性内切酶 基因体外分析研究人工重组 。Date92、DNA连接酶作用：能把不同DNA片段结合到一起。1967，首次发现，但活性不高 1970，Khorana，T4 DNA连接酶，高活性 Date103、DNA聚合酶DNA聚合酶能以单链DNA为模板合成互 补的DNA链。 TaqDNA聚合酶：耐高温，70以上合 成DNA。 这为体外人工大量复制目标DNA片段
4、提 供了极大的方便。 Date114、反转录酶反转录酶也是一种DNA聚合酶，但它不 是以DNA为模板，而是以mRNA为模 板进行DNA的合成。 由于这一过程正好与mRNA的转录过程 相反，故而称为反转录酶。 反转录酶使得基因工程学家们能通过细 胞质中的mRNA来认识和分离目标基 因。 1970，Baltimore和Temin，各自发现。 Date12四、基因工程载体载体：将外源DNA携带进入宿主细胞的 运载工具。 基因载体的实质：一类小型的DNA分子 。 其作用：将目的基因转移到受体细胞， 并使其在受体细胞中得到转录和表达 。 1946，Lederberg，细菌F因子 1973，Cohen，首
5、次将质粒作为基因载 体。 Date13理想载体的特点自我复制能力； 大小要适度，能从外部进入细胞； 稳定安全可靠，不易降解； 要有遗传标记和选择性的识别标记。 Date14载体的分类（1）根据克隆外源DNA的方式：插入型载体：指在载体的克隆位点上用限制性内切酶 酶切后，将外源DNA插入，再用连接酶连接。绝大 多数的载体都属于此类。 置换型载体：指载体的某一片段用限制性内切酶切除 ，代之以外源DNA片段。噬菌体属于此类。 （2）根据载体的用途： 克隆载体：指克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进 行增殖，使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。 表达载体：将外源DNA在宿主细胞中表达产生蛋白质 。 D
6、ate15常用基因载体质粒 噬菌体 病毒 转座子 人工载体Date16质粒质粒是独立与染色体之外的能自主复制 的双链环状DNA分子，也叫“核外遗传 体或核外染色体”。质粒所携带外源DNA片段比较小（ 10Kb）。 Ti质粒：高等植物基因工程常用。Date17噬菌体噬菌体所能负载的DNA片段较大。噬菌体：双链线性DNA。 原核生物常用。Date18病毒SV40（猿猴病毒），双链环状DNA广泛应用：微生物和哺乳动物体细胞基因工程 。Date19转座子能在基因组中频繁转移，主要成分也都 是不同的DNA。 Date20人工载体YAC（酵母人工染色体）Yeast artificial chromosom
7、e BAC（细菌人工染色体）Bacterial artificial chromosome MAC（哺乳动物人工染色体）Mammalian artificial chromosomeDate21第二节 基因工程操作程序一般包括5个步骤：一、目的基因的获得；二、目的基因与基因载体的体外重 组；三、重组DNA分子的转化；四、转化细胞的筛选；五、目的基因表达的检测。 Date22基因转化操作过程 Date23一、目的基因的获得目的基因：在基因工程操作中所需要的 某些DNA分子的片段。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。 目的基因获得方法：人工合成法、cDNA法、PCR法、基因文库筛选法等。 Da
8、te241、人工合成法核苷酸 酶 目的基因注：该法合成目的基因较小。Date252、cDNA法特定基因分离 mRNA 反转录酶 G、C、T、A 单链cDNA目的基因 Date263、PCR法前提：已知序列 方法：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 程序：通过DNA模板高温变性、模板与 引物的低温退火及引物的中温延伸3个 阶段的多次循环，就可以扩增得到目 的DNA序列。 Date274、基因文库筛选法基因文库就是保存某个物种完整基因组 遗传信息的不同DNA片段的总称。 前提：核酸序列未知 程序：蛋白质纯化测定部分氨基酸 的顺序合成DNA探针从基因 文库中
9、筛选目的基因。 原理：中心法则 Date28二、体外重组载体+目的基因 重组DNA（基因工程最重要的环节） 1、选择适合的基因载体 2、载体酶切（限制内切酶） 3、目的基因与载体DNA 连接（DNA连 接酶） 4、重组DNA分子获得Date29三、重组DNA分子的转化将重组的DNA杂合分子，向选定的生物 受体细胞（或叫宿主细胞、寄主细胞 ）中转移，让重组的DNA杂合子在受 体细胞中自主复制、转录、翻译得以 表达。 常用大肠杆菌作为宿主细胞。Date30常用转化方法 （1）Ti质粒介导法 （2）电击法 （3）微注射法 （4）基因枪法 Date31（1）Ti质粒介导法 基因载体：农杆菌Ti质粒。优
10、点：转化再生率高 最常用的方法。Date32（2）电击法 瞬间电脉冲刺激细胞膜小孔 重 组DNA分子进入细胞的通道。电脉冲强度孔径大小和数量 DNA进入细胞的速度和难易。 Date33（3）微注射法 毛细管针显微操作注射外源基 因细胞。优点：准确性高 缺点：技术性高，处理效率低 Date34（4）基因枪法 特制“基因枪” 外源基因+金属微粒 =“微型弹” 射入受体细胞。优点：批量处理，效率高； 缺点：装置昂贵。 Date35提高转化率的方法 （1）多聚氨基酸法 （2）磷酸钙DNA共沉淀法 （3）脂质体法 Date36（1）多聚氨基酸法 多聚氨基酸 + 重组DNA分子DNA多聚氨基酸复合分子常用
11、：多聚-L-鸟氨酸多聚-L-赖氨酸 该结构：保护外源基因免受核酸酶的 降解。 刺激宿主细胞提高其摄入能 力。 Date37（2）磷酸钙DNA共沉淀法 D重组NA分子 + 磷酸钙磷酸钙-DNA复合体（沉淀状）作用：同上法。Date38（3）脂质体法 重组DNA悬浮液 + 10%矿物油或橄榄油剧烈振荡包膜 脂质体（内裹DNA分子）稳定性好，对核酸酶具有较好的抗性。 Date39四、转化细胞的筛选转化处理受体细胞培养基（抗菌素）转化细胞（抗性基因） 未转化细胞培养 重组DNADate40五、目的基因表达的检测合成 外源基因 蛋白质 检测Date41六、基因工程操作实例 抗除草剂和多价抗虫基因导入水
12、稻光温敏核不育系的研究1. Epsps基因为筛选标记的多价抗 虫表达载体构建Date421.1 多基因表达载体构建的流程和图谱Date43pC1300pCTSM1300pCT-pinII-1pCT-Bt-2pCTSKC3Date441.2 .载体构建的部分电泳鉴定图谱图1-3 pCT-Bt-2正向连接酶切鉴定 Lane1: 15kb DNA marker Lane2: pCT-Bt-2/Hind Lane3: pCT-Bt-2/ KpnI+XhoI Lane4: pCT-Bt-2 /KpnI图1-4 pCT-Bt-2反向连接酶切鉴定 Lane1: pCT-Bt-2/Hind Lane2: pC
13、T-Bt-2 /KpnIXhoI Lane3: pCT-Bt-2/PstI Lane1: 15kb DNA marker图图1-1 pCTSM1300酶切鉴鉴定 Lane1: 15kb DNA marker Lane2: pCTSM1300/ EcoRI+XhoI2320 bp图1-5 载体pCTSKC3的酶切鉴定 Lane1: 15kb DNA marker; Lane2: pTSM/EcoRI+XhoI; Lane3: pCTSM1300/ EcoRI+XhoI; Lane4: pKC-3/KpnI+Hind; Lane5: pCT-pin-1/ KpnI+Hind ; Lane6: pC
14、T-pin-1/Hind; Lane7: pCT-Bt-2/Hind; Lane8: pCT-Bt-2/KpnI; Lane9: pRSs1GNA/ KpnI ; Lane10: pCTSKC3/ KpnI3000 bp4500 bp8200 bp图1-2 pCT-PinII-1酶切验证 Lane1: DNA marker (DL15000) Lane2: pCT-PinII-1/ KpnI+ HindIII3000 bp图1-6 GNA基因的PCR鉴定 Lane1,2: pCTSKC3 （460bp） Lane3 : pKC-3 （460bp）220bp1.3 Kb图1-7 TSP和aroA
15、M12基因的PCR鉴鉴定 Lane1: 15kb DNA marker Lane2 , 3: TSP sequence (200bp) Lane4, 5: Epsps gene (1.3kb)图1-8 Bt 和 PinII 基因的PCR鉴定 Lane1: pCTSKC3 /Bt gene（300bp） Lane2 : pCTSKC3 / PinII gene （566bp） Lane3 : pKC-3 /PinII gene（566bp） Date452 2转抗草甘膦基因和多个抗虫 基因水稻植株的获得 2.1 水稻胚性 愈伤组织的 诱导2.2 水稻胚性 愈伤组织的 转化Date46愈伤组织诱导
16、生长过程图接种7d的愈伤组织 刚接种的愈伤组织继代3次的愈伤组织接种14d的愈伤组织继代1次的愈伤组织继代3次以上的愈伤组织Date472.2 愈伤组织的转化基因枪法和农杆菌 法 2.2.1 材料 生长旺盛，结构致密，颜色淡黄的 胚性愈伤组织 多基因表达载体pCTSKC3 ， pCAMBIA1300 农杆菌株EHA1052.2.2 基因枪转化法 转化前，将愈伤组织按每皿25-30块 ，放置在平皿 中心 2.5cm范围内， 然后置于高渗培养基上暗培养 4h。Date48质粒DNA用量约 25ug/ 6枪，可裂膜的压力 为 7.58MPa，靶材料至可裂膜距离为 6cm, 真空度0.08 Mpa，每皿材料 轰击2次 。2.2.3 农杆菌转化法 质粒DNA转化农杆菌EHA105 。 菌
