《中图版生物选修1第一节《 蛋白质的提取和分离》(素材)教学设计》由会员分享,可在线阅读,更多相关《中图版生物选修1第一节《 蛋白质的提取和分离》(素材)教学设计(3页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、 中小学教育资源站(http:/),百万资源免费下载,无须注册!中小学教育资源站 http:/ 6.16.1 蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离问题:问题:斐林试剂和双缩脲试剂成份相同,为什么斐林试剂不能用来检测蛋白质?斐林试剂和双缩脲试剂成份相同,为什么斐林试剂不能用来检测蛋白质?(1)溶液浓度不同 斐林试剂中乙液为 0.05g/ml 的 CuSO4 溶液,双缩脲试剂中 CuSO4 溶液为 0.01g/ml(2)使用原理不同 斐林试剂是新配制的溶液,它在加热条件下与醛基反应,被还原成砖红色的沉淀,可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时,溶液的颜色变化过程为:浅蓝色棕色砖
2、红色(沉淀)。 鉴定生物组织中是否含有蛋白质时,常用双缩脲法,使用的是双缩脲试剂,发生的是双缩脲反应。双缩脲反应实质是在碱性环境下的与双缩脲试剂发生的紫色反应。而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键,所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应,可以用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。 (3)使用方法不同 斐林试剂使用时,先反溶液和溶液混合(将滴溶液滴入溶液中),而后立即使用,需要加热。来源:学科网来源:学+科+网双缩脲试剂使用时,先加入溶液(2mL),振荡摇匀,造成碱性的反应环境,然后再加入 34 滴溶液,振荡摇匀后观察现象。(4)颜色反应不同 斐林试剂与还原糖混合是产生砖红色沉淀,双缩脲试剂与蛋
3、白质反应产生紫色反应。来源:Zxxk.Com来源:学科网 ZXXK一、植物组织蛋白质提取方法 来源:学科网 ZXXK1、根据样品重量(1g 样品加入 3.5ml 提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。3、用离心机离心 8000rpm40min4或 11100rpm20min44、提取上清液,样品制备完成。蛋白质提取液:300ml1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml2、甘油(Glycerol)75ml3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对 SDS-P
4、AGE,垂直板电泳!来源:Zxxk.Com二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积 3 倍的提取液在-20的条件下过夜,然后离心(48000rpm 以上 1小时)弃上清。中小学教育资源站(http:/),百万资源免费下载,无须注册!中小学教育资源站 http:/ 3、加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的 -巯基乙醇),摇匀后离心(48000rpm 以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。来源:学科网 ZXXK4、上样前加入裂解液,室温放置 30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(158000rpm 以上 1 小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临
5、时保存在 4待用。5、用 Brandford 法定量蛋白,然后可分装放入-80备用。药品:提取液:含 10%TCA 和 0.07%的 -巯基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于 3ml 灭菌的去离子水中(终体积为 5ml),使用前再加入 1M 的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!来源:学.科.网 Z.X.X.K 三、植物材料:水稻苗,叶鞘,根1、200 毫克样品置于冰上磨碎2、加 lysis buffer,离心,10000rpm,4 度,5min 取上清3、重复离心 5minlysis bu
6、ffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40来源:学,科,网 四、蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等(1986)的方法进行。100mg 材料剪碎后加入 10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入 1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含 10mM 即 0.07%-巯基乙醇),混匀,-20沉淀 1 小时,4,15000 r/min 离心 15 min,弃上清,沉淀复溶于 1.5ml 冷丙酮(含 10 mM-巯基乙醇),再于-20沉淀 1 小时,同上离心弃上清,(有必要再用 80丙酮(含 10 mM-巯基乙醇所
7、得沉淀低温冷冻真空抽干。按每 mg 干粉加入 20l(可调) UKS 液9.5 M 尿素,5mM 碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100 ,37温育 30min,期间搅动几次,28 度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min 离心 15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70 度保存来源:Z,xx,k.Com五、植物根中蛋白质的抽取(1) sample, 液氮研磨(2) 装 1.5 ml centrifuge 用 tube(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul(4) 12000 rpm, 4 度, 10-15minite(5) 取上层液,蛋白质就在里面 来源:学.科.网 Z.X.X.K来源:Z|xx|k.Com中小学教育资源站(http:/),百万资源免费下载,无须注册!中小学教育资源站 http:/