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1、质粒质粒DNADNA的酶切鉴定的酶切鉴定限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。实验原理实验原理限制性内切 酶切割DNAConstruction of pGEX-740A:B:Strategy of constructionC: Identify positive cloneThe product of PCRX-gene cDNALiga
2、tionAmprf1 oripGEX Vector (4900 bp)BamH I EcoR IAmprpGEX-740 (5640 bp)740 bppGEM-xy1Primer2Primer1740 bpBamHI+EcoRIf1 ori1 2 31. 740 bp 2. pGEX-vector 3. Marker740 bp4900 bp740 bpM 14900 bp5640 bp 4900 bp740 bp在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（l） 质粒DNA1010T Buffer2RNase A1BamH I1EcoR I1H2O5总计20实验方案实验方案注
3、意采用混合配样酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading buffer，中止反应，混匀。2025 ul上样，在一个泳道中加入10 ul DNA Marker。根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。核酸电泳(一) 琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：1. 核酸分子
4、大小 迁移率与分子量对数成反比。2. 胶浓度: 迁移率与胶浓度成反比。3. DNA 的构象: 一般条件下迁移率:超螺旋DNA 线形DNA开环DNA4. 电压: 一般不大于5V/cm。在适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比。5. 碱基组成: 有一定影响，但影响不大。6. 温度： 430都可，常在室温。电泳时，在胶中加人荧光染料如溴化乙锭(EB)，EB为扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与EB结合后，紫外光照射时可发射出红橙色可见荧光。Eb可引起移码突变。溴化乙锭吖啶橙放射菌素DDNA鉴定的三种荧光染料及与DNA的相互作用（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作支持物。常用垂直板电泳。
5、单体丙烯酰胺在加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分析分子量小于1000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的核酸样品不能用此法检测出注意事项注意事项1. 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。2. 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做9份酶切 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。3. 上样时要小心操作，防止样品溢出。4. 接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套，废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！5. EB是极强致癌物！小心！思考题思考题1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应 效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？
