《[工学]第八章-微生物药物的分离与精制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[工学]第八章-微生物药物的分离与精制（85页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 第九章-微生物药物的分离精制l知识目标：1.了解微生物工程下游加工 过程的原理和方法。l 2.掌握各种沉淀方法。l 3.掌握溶剂萃取的原理和方 法。l技能目标：1.能够正确地选择离子交换 树脂和控制操作条件。l 2.熟练掌握各种沉淀的操作 与结晶方法。第一节 概述l一、微生物工程下游加工过程的特点l 培养液(或发酵液)是复杂的多相系统， 含有细胞、代谢产物和未用完的培养基 等。分散在其中的固体和胶状物质，具 可压缩性，其密度又和液体相近，加上 黏度很大，属非牛顿性液体，使从培养 液中分离固体很困难。l培养液中所含欲提取的生物物质浓度很 低(几种不同类型产品的浓度示于下表中) ，但杂质含量却很
2、高，特别是利用基因 工程方法生产的蛋白质，常常伴有大量 性质相近的杂质蛋白。从低浓度的混合 物中分离纯组分，需要较大的能量。l下游工程l第一个特点-即起始浓度较低而杂质又 较多，最后成品要求达到纯度又较高， 因此常需多步纯化操作。一个包含6步操 作的纯化过程，即使每步作都较完善， 收率达到90%，总收率也只有53%。可见 ，尽量减少提取步骤是相当重要的。l第二个特点-是欲提取的生物物质通常 很不稳定，遇热、极端pH值、有机溶剂 会引起失活或分解，特别是蛋白质的生 物活性与一些辅因子(cofactor)、金属 离子的存在和分子的空间构型有关。一 般认为剪切力( shear)会影响空间构型 和使分
3、子降解，对蛋白质的活性影响很 大。最近的研究则表明，当蛋白质分子 处于气液交界面上或与膜结合的蛋白质 均对剪切力较敏感，而溶解的蛋白质则 受影响较小。l第三个-特点是发酵或培养都是分批 操作，且微生物总有一定的变异性， 故各批发酵液不尽相同，这就要求下 游加工有一定的弹性，特别是对染菌 的批号，也要求能处理。l二、微生物工程下游加工的一般过程和 单元操作l大多数产品的下游加工过程常常按照生 产过程的顺序分为4个步骤，即发酵液的 预处理和固液分离、初步纯化(提取)、高 度纯化(精制)、最后纯化(成品加工)，见 后面图所示l 发酵液的预处理和固液分离是采用 凝聚和絮凝等技术，加速固、液两相分离 ，
4、提高过滤速度。发酵产品如果是胞内产 物，首先要进行细胞破碎，再分离细胞碎 片。 l 初步纯化即提取，主要是除去与目 标产物性质有很大差异的物质，使产物浓 缩以及产品质量提高。常用方法有沉淀、 吸附、萃取等。 l 高度纯化即精制，采用对产品有高 度选择性的分离技术，除去与产物理化性 质相近的杂质。典型的方法有层析、离子 交换等。 l 成品加工是为了获得质量合格的产 品，常用浓缩、结晶、干燥等技术方法。第二节 发酵液的预处理及固液分离l 发酵液的预处理及固液分离是发酵液下 游加工的第一步操作。预处理的目的是 改善发酵液的性质，去除部分可溶性杂 质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利于 提取和精制工序的操
5、作。在预处理中常 用酸化、加热、加絮凝剂等方法，而固 液分离则常用过滤、离心等方法。如果 目的产物存在于细胞内，则需要收集菌 体或细胞，并对细胞进行破碎。l一、发酵液的预处理l1.高价无机离子的除去l发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+ 等。l去除钙离子通常使用草酸。草酸为弱酸，对发 酵产物破坏作用较小。l去除Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可 溶性络合物，可消除对离子交换的影响。l去除铁离子可用黄血盐。黄血盐与铁离子形成 普鲁士蓝沉淀。l2.杂蛋白的除去 lA-沉淀法 注意：仅靠调pH值不能 使大部分蛋白质沉淀，还必须与其 他方法共用。在酸性溶液中，蛋白 质与一些阴
6、离子如三氯乙酸盐、水 杨酸盐、过氯酸盐等形成沉淀;在碱 性溶液中，能与Ag+,Cu2+,Zn2+等阳离 子形成沉淀。或者加入碱金属中性 盐作为脱水剂，破坏蛋白质分子的 水化层，使蛋白质沉淀。lB-变性法蛋白质变性后，溶解度降低 真至沉淀。使蛋白质变性的方法很多 ，最常用的是加热法。它是在目的产 物耐热性允许的范围内，采用加热处 理发酵液的方法。变性法也有一定的 局限性,如加热法只适合对热较稳定 的目的产物，过酸过碱可能会导致某 些产物失活。lC-吸附法 利用某些吸附剂或沉淀 剂的吸附作用去除杂蛋白质。例如 在枯草芽孢杆菌发酵液中，常加入 氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞 大的凝胶，把蛋白质、菌体
7、、其他 不溶性粒子吸附进去、包裹在其中 而除去。l3.色素及其它物质的去除l 色素可能是微生物代谢过程分泌的，也 可能是培养基(如玉米浆等)带来的。对 于药用发酵产品，特别是针剂产品要求 不含色素、热源物质和毒素物质等。常 用的脱色方法有离子交换剂、离子交换 纤维、活性炭等材料的吸附法。l二、离心过滤与固液分离l发酵液中除了发酵产物，还含有大量的 固体如菌体。为了方便提取和精制的进 行。应该将菌体与发酵液分离。菌体分 离通常采用离心分离和过滤两种方法。l1.影响发酵液过滤的因素l 发酵液属于非牛顿性液体，黏度大， 过滤速度慢。发酵液的过滤速度与菌体 细胞体积、各种发酵条件、未利用完的 培养基浓
8、度、消泡剂、发酵周期等有关 。l 2.改善发酵液过滤性能的方法l 发酵液难以过滤时，需要通过改善 过滤性能，降低滤饼比阻的方法，来提 高过滤与分离的速率。改善发酵液性能 的方法有调酸、热处理、添加凝聚剂、 反应剂、助滤剂等。l(1)调pH值 利用酸来调节发酵液pH值 ，使之达到等电点，可除去蛋白质等两 性物质。膜过滤中，发酵液中的大分子 物质易与膜发生吸附，调pH值后，改变 了易吸附分子的电荷性质，减少堵塞和 污染。l (2)凝聚与絮凝 凝聚作用是指向胶体 悬浮液中加人凝聚电解质(如硫酸铝、氯 化铁等)，在电解质中异电离子作用下， 胶粒的双电层电位降低，胶体粒子间相 互碰撞而产生凝集的现象。絮
9、凝作用是 指悬浮液中加入聚丙烯酞胺、聚丙烯酸 钠、聚季按醋等絮凝剂后，由于这些高 分子化合物呈长链状结构，分别吸附在 不同胶粒表面，产生桥架连接时，形成 较大的絮团。l (3)吸附剂法将吸附剂加到细菌悬 浮液中，使细菌细胞吸附在吸附剂 上。常用的吸附剂有CaHPO4凝胶、氧 化铝凝胶等。l (4)助滤剂法加适量的硅藻土于 细菌悬浮液中，细菌细胞吸附在硅 藻土粒子表面，从而改变了滤饼结 构。它的可压缩性下降了，过滤阻 力降低了，因而能够加快过滤速度 。l(5)反应剂法某些不影响目的产物的 反应剂加人后可以和某些可溶性盐类 发生反应，形成不溶性沉淀(如CaSO4 等)。沉淀既能防止菌丝体豁结，又
10、可作为助滤剂，并能使胶状物和悬浮 物凝固，从而改善过滤性能。l三、细胞破碎与分离l 微生物的代谢产物并非都是分泌型 的，部分可以直接分泌到细胞外， 部分存在于细胞内部。如果是胞外 产物，可以很方便地对发酵液进行 预处理及过滤。如果要分离和提取 的是胞内物质，如有些酶制剂、干 扰素、胰岛素等，那么首先要收集 菌体，进行细胞破碎，使代谢产物 转人液相，再进行细胞碎片的分离 。第三节 微生物药物的分离和精制l一、萃取法l二、沉淀法l三、膜分离技术l四、树脂法l五、吸附法l六、凝胶层析法第一部分 萃取l萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质的得到纯化或浓缩的方法l根据参与溶质分配的两
11、相不同分类：l 液固萃取、溶媒萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取l一、溶媒萃取法l1、溶媒萃取的基本原理l 利用该物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使之从一种溶剂转入另一种溶剂，从而使杂质去除l萃取效率是以分配定律为基础的lNernst 分配定律（1891）：在一定温度下，当某一溶质在两种互不相溶的溶剂中分配达到平衡时，则该溶质在两相中的浓度之比为一常数，称为分配系数。对萃取操作来讲：萃取相和萃余相中溶质的浓度之比就是分配系数；用K表示。在达到平衡时，设溶质在萃取相中浓度为CA ；在萃余相中为CB 。则：l2、常用溶媒萃取的工艺l（1）单级提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液残余液l
12、（2）多次提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液混合器溶剂分离器提取液混合器分离器提取液残余液溶剂残余液残余液l（3）、多级对流萃取第 一 混 合 器分 离 器第 二 混 合 器分 离 器第 三 混 合 器分 离 器最后提取液提取液残余液残余液最后残余液提取液溶剂发酵液一级二级三级A 90%A 70%A 50%l3、影响溶媒萃取的主要因素l(1)乳化与去乳剂l乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系l乳浊液的形式：水包油、油包水l常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法l常用去乳剂：阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶） 阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）l
13、（2）pH值l 红霉素在pH9.8时，在乙酸戊酯与水相间的分配系数等于44.7，而在pH5.5时，红霉素在水相与乙酸戊酯间的分配系数等于14.4。l （3）温度l （4）盐析l （5）带溶剂l 带溶剂是指这样一种物质，能和被萃取物质形成复合物而易溶于溶媒中，形成的复合物在一定条件下又容易分解l 例如：链霉素在中性下能与二异辛基磷酸酯结合，从而在水相萃取到三氯乙烷中，然后在酸性下再萃取到水相l二、双水相萃取l1、发展历史l 始于20 世纪60年代,从1956 年瑞典伦德大学Albertsson 发现双水相体系l 1979 年德国GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离 l国
14、内自20世纪80 年代起也开展了双水相萃取技术研究。l2、双水相的形成l 将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系l 形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。l3、常用的双水相体系l 高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 和PEG/ Dextran l 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系
15、。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。l4、双水相相平衡关系l5、影响物质分配平衡的因素l（1）聚合物及其分子量的影响l 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:l 葡萄糖硫酸盐P21萃取槽； 2膨胀阀；3分离槽； 4压缩机T1T2P2溶质13P124T1T2 P1=P21萃取槽； 2加热器；3分离槽； 4泵；5冷却器P2T2T15溶质(3) 吸附法1 3P12 4T1=T2 P1=P21萃取槽； 2吸附剂；3分离槽； 4泵；P2T2T1超临界萃取的三种典型流程6、应用举例第二部分 沉淀法 P164l1.等电点沉淀法 l2.盐析法
16、l3.有机溶剂沉淀法l4.非离子型聚合物沉淀法第三部分 膜分离技术lP166l1.膜分离技术分类lA-透析 B-电渗析 C-微滤 D-超滤 E-反渗 透 F-纳米过滤l2.离子交换膜电渗析法第四部分 树脂法l 离子交换技术是根据物质的酸碱度、极 性和分子大小的差异予以分离的技术， 它所使用的离子交换剂是能和其他物质 发生离子交换的物质，分为无机离子交 换剂和有机离子交换剂(离子交换树脂) 。在发酵工业中，用离子交换树脂法分 离提纯各种生物活性代谢物质，具有成 本低、操作方便、设备简单、提炼效率 高、节约大量有机溶剂等优点。第五部分 吸附法 l 吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质 、有毒物质(如热源质)、抗生素之间的分 子引力，
