抗生素生产工艺系列3

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1、抗生素工业生产第二部分1 1菌种优化抗生素发酵及 提取精制工业生产方法 及总的工艺抗生素生产菌 的菌种菌种来源内 容 速 览2 2抗生素的工业生产方法及工艺介绍第一节3 3教学目的：了解了解抗生素工业生产方法及工业产生的特点抗生素工业生产方法及工业产生的特点; ;了解了解抗生素工业生产与一般制药工业比较存在问题抗生素工业生产与一般制药工业比较存在问题; ;掌掌握握抗生素生产工艺过程抗生素生产工艺过程。教学重点、难点：教学重点、难点：生物合成法生产抗生素的工艺过程。生物合成法生产抗生素的工艺过程。4 4工业生产方法生物合成法全化学合成法半化学合成法一、抗生素的工业生产方法5 51、生物合成法 生

2、物合成法（即微生物发酵法）：是利用特定的微生物，在一定的条件下（培养基、 温度、pH、通气、搅拌等）使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当化学手段将抗生素从发酵液中提取、精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。6 67 71、生物合成法 传统方法； “工程菌”制造法； 细胞融合技术法 。8 8传统方法传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。大多数抗生素是由放线菌产生的。菌种通过从土大多数抗生素是由放线菌产生的。菌种通过从土壤中分离、筛选获得

3、，一般采用壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐深层通风搅拌发酵罐生产。生产。9 9 “工程菌”制造法我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。第一次由第一次由“ “工程菌工程菌” ”制造的全新抗生素制造的全新抗生素麦迪紫红麦迪紫红 素素A A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基 因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“ “工程菌工程菌” ”产生产生了全新的抗生素。了全新的抗生素。

4、1010细胞融合技术法目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的新型抗生素问世。对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原 菌株提高菌株提高140140倍。倍。返回11112、全化学合成法（即化学合成法）：（即化学合成法）：某些抗生素的化学某些抗生素的化学结构已经明确且较简单时，可采用全化学结构已经明确且较简单时，可采用全化学的方法进行合成制取抗生素。的方法进行合成制取抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。如：氯霉素

5、、磷霉素等。1212氯霉素分子结构图1313氯霉素的合成 1414合成路径为起始原料溴代 成盐水解成胺酯化羟醛缩合选择性还原（）苏阿糖型酯水解酸碱中和拆分D（-）苏阿糖型成酰胺1515全化学合成法的优缺点l优点效率较高，受 影响因素少， 克服了发酵法 生产的缺点。1616l缺点导致严重的环 境污染问题。返回17173、半化学合成法即半合成法，将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团,进行分子结构改造而获得的新抗生素品种或制成各种衍生物。1818:生物合成法制取:化学方法改造l半化学合成法此种方法一般分两个阶段进行：1919许多细菌逐渐出现了耐药性，已经证实某些耐药因子位于细菌

6、内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果耐药菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。2020半合成抗生素的目的：增强抗菌力；12对耐药菌有效；34降低毒副作用或提高生物有效性。5扩大抗菌谱；便于口服；2121二、生物合成法生产抗生素 的工艺过程2222抗生素总的生产工艺过程菌种孢子制备种子制备 发酵精制过程成品检验提取过程成品包装发酵液预处理及过滤出厂检验2323微生物合成抗生素上游：菌种保存、

7、选育、孢子及种子制备发酵适宜的培养基碳源 氮源 无机盐（微量元素）前体下游：提取 预处理 过滤 进一步提取结晶干燥纯品 成品:制剂工作242425251、产生菌种菌种：来源于自然界，得到能产生抗生素的微生物，经分离、选育和纯化后的物质； 保藏：冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱 (-190-196)内保藏； 复壮：一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产 能力。 2626条 件：生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验 ，若符合规定，才能用来制备种子； 孢子制备：将保藏的处于休眠状态的孢子，在严格的 无菌条件下，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基

8、 上，在一定温度下培养5-7日或7日以上，这样培养出 来的孢子数量还是有限的； 扩大培养：必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如 小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。 2、孢子制备2727目 的：使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中； 方 法：可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐 级扩大培养或直接将孢子接入种子罐逐级放大 培养。 扩大培养：级数通常为二级。 3、种子制备2828种子扩培工艺流程1.砂土孢子 2.冷冻干燥孢子 3.斜面孢子 4.药瓶液体培养 5.茄子瓶斜面培养 6.固体培养基培养 7、8.种子罐培养 9.发酵罐2929在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样

9、，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。培养基主要成分包括碳源、氮源、无机盐类(包括微 量元素)和前体等。4、培养基的配制3030(1)碳源 l主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一；l常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。3131(2)氮源l主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质 、核酸)和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。l有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉 米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和 菌丝体等。l无机氮源：氨水

10、(氨水既作为氮源，也用以调节pH)，硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。3232(3)无机盐和微量元素抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要 某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓 度与菌种的生理活性有一定影响。3333(4) 前体(precursor) l定义：在抗生素生物合成中，菌体利用它 以构成抗生素分子中的一部分而其本身又 没有显著改变的物质。l前体除直接参与抗生素生物合成外，在一 定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并 增加抗生素的产量。l前体的加入量应当适度。3434(5)培养基的质量 1）在必要时作摇瓶试验以控制其质量；2

11、）培养基的储存条件对培养基质量的影响；3）培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质；4）培养基初始pH亦要严格按规程执行。35355、发 酵定 义：利用为生物体的代谢作用，并借 助于代谢过程的控制来获得产品的过程。目 的：使微生物大量分泌抗生素。36365、发 酵灭 菌：在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接 种：将活化的菌种转移到无菌的培养基， 接种量一般为10%或10%以上。37373838发酵控制1）发酵时间：视抗生素品种和发酵工艺而定。2）溶 氧：在整个发酵过程中，需不断通无菌空气 和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。3）控制灌温：在罐的夹

12、层或蛇管中需通冷却水以维持 一定罐温。4）消 泡： 加泡沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、 碱以调节发酵液的pH。3939发酵控制检测指标：定时取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形态和 浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解 氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。对有的抗生素在发酵过程中还需加入葡萄 糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。4040目 的：分离菌丝、去除杂质；多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中；个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗 生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。 6、发酵液的过滤和

13、预处理4141发酵液的预处理加热、大幅度调pH和加絮凝剂等方法使蛋白质变性；加入草酸、三聚磷酸钠（Na5P3O10）、黄血 盐等可除去Ca2+，Mg2+，Fe2+等无机离子。4242发酵液的过滤板框过滤机板框过滤机鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机4343自动出渣离心机自动出渣离心机倾析器倾析器发酵液的过滤44447、抗生素的提取l提取目的：从发酵液中制取高纯度的符合药典 规定的抗生素成品。l提取要求： 1)时间短；2)温度低；3)pH宜选择 对抗生素较稳定的范围；4)勤清洗消毒(包括厂 房、设备、管路并注意消灭死角)。l提取方法： 1)溶媒萃取法； 2)离子交换法；3)其他提取方法 4545溶媒萃

14、取法利用抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态(游离酸、碱或成盐)存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相(如发酵滤液)转移到另一种液相(如有机溶媒)中去，以达到浓缩和提纯的目的。4646离子交换法利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的 条件将抗生素从树脂上洗脱下来。4747缺点：缺点：生产周期长，对某些产品质量不够理想优点：成本 低、设备简 单、操作方 便离子交换法4848其他提取方法由于近年来许多抗生素发酵单位已大幅度提高，提取方法亦相应适当简化。直接 沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的

15、一种。例：四环素的提取49498、抗生素的精制对产品进行精制、烘干和包装阶段要符合“药品生产管理规范”（GMP）的规定。5050抗生素精制的方法1、脱色和去热原质2、结品和重结晶A. 改变温度结晶B. 利用等电点结晶C. 加成盐剂结晶D. 加入不同溶剂结晶3、其他精制方法51511、脱色和去热原质色素是发酵过程中产生的代谢产物，与菌种及发酵条件有关，常用活性炭脱色。热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生 的一种内毒素。G-产生的热原反应高于G+，是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，引起恶寒高热，甚至休克 。常用活性炭吸附或超微过滤办法去除。52522、结晶和重结晶A.改变温度结晶 利用抗生素

16、在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。例:制霉菌素的浓缩液在5条件下保持4-6h后即结晶完全，分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。 5353当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀 析出。例：6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液当pH调至等电点(4.3)时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。B.利用等电点结晶5454C.加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结晶。例：在青霉素G或头孢菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。5555D. 加入不同溶剂结晶利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。例：巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的 性质。在其浓