《生化分离-预处理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化分离-预处理（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物分离的前处理 发酵液的预处理E. coli2.发酵液的预处理 2.1 发酵液的特性和预处理的目的 2.2 预处理加热 2.3 预处理调节pH值 2.4 预处理加入助滤剂 2.5 预处理加入反应剂 2.6 预处理凝聚 2.7 预处理絮凝2.1 发酵液的特性和预处理的目的无论产物在胞内还是在胞外或是菌体本 身，都首先需要进行发酵液的预处理和固液分 离，以使产品可以从澄清的发酵液中提取，或 是从收集的固体（菌体）进行破碎、提取分离 胞内的产物。intracellular：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 等 extracellular：抗生素（青霉素、红霉素）、有机酸（柠檬酸、 乳酸）、胞
2、外酶（-淀粉酶）等微生物发酵液的特性：发酵产物浓度较低，大多为1 10，有的甚至更低，悬浮液中 大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液 相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 经常含有一些粘性物质，如蛋 白质、核酸和多糖等，液相粘度 大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定且随时间变化，如 易受微生物污染、空气氧化、蛋 白酶水解等作用的影响。这些性质使得发酵液 的过滤与分离相当困难!工业生物技术中典型固相的形态（非标尺）尺寸增加回收费费用增加表 工业业生物技术术中典型的固体粒子固体离子的 类类型尺寸（ mm）细细胞碎片Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。从上面的理论可以看出，胶体结构中的双
3、 电层受压缩变薄时，会降低电位，当电位降低到 相当小时，颗粒就会因互相吸引而产生疏松的絮凝 体。电解质可以中和颗粒表面的电荷而压缩胶体中 的双电层。但如果双电层的压缩不能大量地减少胶 体颗粒表面的电荷，因此产生的疏松的絮凝体容易 在物理因素的作用下重新分散。 2.6.3常用的凝聚剂常用的凝聚剂见表3，可以看到，常用 的凝聚剂主要都是一些无机盐电解质。分 类类物 质质 无机盐盐Al2(SO4)3，AlCl3, Fe2(SO4)3, FeCl3, FeSO4, NaAlO2, CaCl2, ZnCl2, Na2CO3, 酸H2SO4, HCl, H2CO3. 碱NaOH, Ca(OH)2, Na2
4、CO3 ,Al(OH)3, Fe(OH)3 固体粉末高岭土、皂土、酸性白土、碳黑、烟灰、明矾矾、聚合氯氯化 铝铝、活性硅胶等。 其他活性硅酸表3 常用凝聚剂种类2.7 絮凝2.7.1絮凝过程的机理絮凝技术和凝聚一样，都能有效地改变细胞、 菌体和蛋白质等胶体分子的分散状态，使其聚集起来， 颗粒体积增大，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度 较大的发酵液的预处理中。除此之外，还能有效除去杂 蛋白质和固体杂质，提高滤液质量，对产品起到初步纯 化作用。但二者的作用机理却有不同，絮凝和凝聚的概 念应加以区分。凝聚是指胶体及悬浮物颗粒表面电荷被中和， 静电排斥力消失，颗粒脱稳而形成细小的凝聚体的过程 。而絮
5、凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成较大絮团的过程。是一种以物理的集 合为主的过程。絮凝作用的过程首先包含着凝聚的作用 ，因此现在多数人都认为絮凝作用的机理是凝聚和絮凝 两种作用的结果。可以认为凝聚作用是颗粒由小到大的 量变过程，而絮凝作用是若干个凝聚作用的结果，当颗 粒聚集到一定程度时，便会从溶液中沉降而分离出来。近年来，发展了不少种类的有机高分子聚 合物絮凝剂，它们具有长链线状的结构，是一种水 溶性的聚合物，分子量可高达数万至一千万以上， 在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有 多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性 （如非离子型）。它们通过静电引力、范
6、德华力或 氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分 子聚合物的许多链节分别吸附在不同胶粒的表面上 ，产生了架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝 作用。高分子絮凝剂的混和、吸附和絮凝作用见示 意图3。凝絮过程中的架桥作用是指溶液中胶体和 悬浮物颗粒通过有机或无机高分子絮凝利吸附，形 成架桥式空间结构的絮凝体而沉淀下来的现象。有 时候也可能是两个同性电荷的胶体颗粒与两个带异 电性的小颗粒连结在一起。图3 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图（a）聚合物分子在液相中分散、均匀分布在粒子之间；（b）聚合物分子链在粒子表面的吸附；（c）被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作用，是架桥
7、作用的平衡构象（d）脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用；（e）絮团的打碎对于带负电性菌体或蛋白质来说，阳离子 型高分子絮凝剂同时具有降低粒子排斥电位和产生 吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用；对于非 离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子 间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与无机电 解质凝聚剂搭配使用。首先加入无机电解质，使悬 浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒， 然后，再加入絮凝剂。无机电解质的凝聚作用为高 分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而，提高 了絮凝效果。这种包括凝聚和紫凝机理的过程，常 称为混凝。表4 凝聚与絮凝的差别别项项目名称凝 聚絮 凝 作用机理电电性中和
8、作用为为主吸附和架桥桥作用为为主 试剂类试剂类 型无机化合物为为主有机高分子聚合物为为主分子量小和中等分子量数万至数千万 絮团团强度较紧较紧 密较较松散 滤饼滤饼 水分较较低较较高 聚集速度较较慢较较快 对对pH的反应应敏感不敏感 试剂试剂 用量较较多，10.1较较少，0.10.01 操作成本较较低廉较较高 对产对产 品的影响试剂试剂 可能进进入产产品基本无影响2.7.2 常用的絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机 合成的聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）类衍生物， 根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子 型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基 ）三类。由于聚丙烯酸胺
9、类絮凝剂具有用量少，一 般以ppm计量；絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度 快以及种类多等优点，所以适用范围广。它们的主 要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯 酰胺，因此，当用于食品及医药工业时，应谨慎使 用，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。近年 来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒， 可用于食品和医药工业中。另外。还有聚苯乙烯类 衍生物及无机高分子聚合物絮凝剂，如聚会铝盐和 聚合铁盐等。除此以外，也可采用天然有机高分子 絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨 胶和壳聚糖等。表5工业业上常用的絮凝剂举剂举 例分 类类举举 例 天然的高分子絮凝剂剂海藻酸钠钠、壳聚糖、多聚糖
10、类类；明胶、干乳酪 、骨胶等 合成的高分子絮 凝剂剂阴离子型聚丙烯烯酸钠钠、聚乙烯烯苯磺酸钠钠等阳离子型聚二甲基胺基甲基丙烯烯酸酯酯、聚二丙烯烯二甲基 氯氯化胺、聚二甲基胺甲基丙烯酰烯酰 胺、聚乙胺等非离子型聚丙烯酰烯酰 胺、聚氧乙烯烯、聚乙烯烯吡咯烷酮烷酮 等两性型改性聚丙烯酰烯酰 胺等壳聚糖2.7.3影响絮凝分离的因素絮凝作用是复杂的物理化学过程，影响 絮凝作用（过程）的因素也是复杂和多方面的 ，如：分子量和类型，絮凝剂的加入量、溶液 的pH，搅拌转速和时间等。同时，在絮凝过程 中，常需加入一定的助凝剂以增强絮凝效果。1、pH对絮凝作用的影响溶液pH值对絮凝作用的影响是非常大的，pH 值的
11、变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度 ，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于 链节上相邻离子基团间的静电排斥作用，而使分子 链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。因此，pH值通过对胶体颗粒表面的带电性 （电位）、絮凝剂的性质的改变对絮凝的作用产 生很大的影响。一般情况下，阳离子型的絮凝剂适 合在酸性和中性的pH值环境中使用；而阴离子型絮 凝剂适合在中性和碱性的环境中使用。聚季铵盐的 阳离子有机高分子絮凝剂也适合在碱性的介质中使 用。非离子型絮凝剂适合于从强酸性到碱性的环境 中使用。2、温度对絮凝作用的影响温度过高或过低都对絮凝不利，一般 絮凝作用最适合的温度在2030之间。水温
12、 过高时，化学反应速度过快，形成的絮凝体细 小，并使絮凝体的水合作用增加，同时能量的 消耗也增大。水温过低，有些絮凝剂的水解反 应变慢，水解时间过长，效率降低；同时温度 低，水的粘度变大，也会增加水对絮凝体的撕 裂作用，使絮凝体变得细小，不易分离。3、搅拌速度和时间对絮凝作用的影响搅拌的速度和时间对发酵液絮凝的影响很大 ，条件选择得恰当，可以加速絮凝作用，有利于絮凝剂 发挥作用，提高絮凝效果。几点结论： （1）絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅 拌应强一些，絮凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅 拌应降低。 （2）增加颗粒浓度，有利于聚并絮凝 。 （3）加大搅拌，增加速度梯度有利于 颗粒聚并，但太大时，剪切
13、力会导致絮凝体破裂 。一般来说，搅拌转速以4080r/min为宜， 不要超过100r/min；搅拌时间以24min为宜，不超过 5min。速度过快，时间过长，会将大颗粒的固体搅碎变 成小颗粒而不能沉淀；搅拌速度过慢，时间过短，絮凝 剂和胶体颗粒不能充分接触，不利于絮凝剂捕集胶体颗 粒，从而难以发挥絮凝作用。谭天伟，沈忠耀.细胞絮凝技术及在生物产品分离中的应用. 生物工程进展，15(5), 5356 (1995)4、高分子絮凝剂的性质和结构对絮凝作用的 影响线型结构的有机高分子絮凝剂，絮凝 作用较好。而环状或支链结构的有机高分子絮 凝剂的絮凝效果较差。有机高分子絮凝剂的一 些官能团如COONa、
14、R3NRCl、CONH2、 SO3Na等过多时，电荷密度过高，絮凝作用差； 官能团较少时，有利于絮凝作用，但过少对电 荷的中和作用不利而影响到絮凝作用。5、高分子絮凝剂的相对分子量对絮凝作用的 影响高分子絮凝剂分子量增大，链增长， 可使架桥效果更明显，所以通常情况下，絮凝 剂的相对分子量越大，絮凝作用越好。絮凝剂 的相对分子量不要小于30000，最好在250000以 上。但是，分子量也不能超过一定的限度，因 为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低 ，因此分子量的选择也应适当。6、絮凝剂的用量对絮凝作用的影响一般情况下，料液中的絮凝剂浓度增加 有助于架桥充分，絮凝作用的效果随着絮凝剂 用量的增
15、加而增大。絮凝剂的用量达到一定值 时，絮凝作用达到最佳效果，但再增加用量时 ，絮凝效果反而下降，因为絮凝剂过量时会使 形成的絮凝体重新变成稳定的胶体。絮凝剂的 用量与溶液中悬浮物的含量有关，所以最佳的 絮凝剂用量应通过实验来确定。 2.7.4絮凝技术的应用和发展动态絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速 度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如 菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量，在生物产品 分离中的应用越来越广泛。Person等曾报导在-半乳糖苷酶（胞内酶） 发酵液中采用絮凝技术除去细胞碎片的方法，利用壳聚糖 （chitosan）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimin
16、e）阳离 子絮凝剂以及氯化钙无机电解质，分别在细胞破碎前后处 理发酵液，有机絮凝剂在破碎前预先加入，其加量为 640ppm，氯化钙在破碎后加入，加量为 40 mmol，并调节 一定的 pH，这样可将细微的细胞碎片粒子聚集起来。絮 凝处理的结果不仅大大改善了离心分离后滤液的澄清度， 使细胞碎片的去除率提高了十倍以上，而且凝固了部分可 溶性杂蛋白质，滤液总蛋白的含量降低了40，实验还证 明，在絮凝过程中，-半乳糖苷酶的活性（U/mL）并没 有受到影响。I Persson and B. Lindman. Flocculation of cell debris for improved separation by centrifugation, in flocculation in biotechnology and separation systems， 457466，Y. A. Attra, ed
