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1、冰冻红细胞制备工艺的标准化 和产品的质量控制广州血液中心 赵阳 一、概述 二、标准化制备 三、质量控制 四、我们的工作 五、展望一、概述 终浓度40%甘油处理的甘油化红细胞，可以保证-65以下红细胞内水不结冰，是国际 通用的红细胞深低温保存技术。 手工法 M115半自动 ACP215全自动国内许多血站都在使用ACP215进行红细胞甘油化和去甘油化的操作，将稀有血型红细胞冰冻保存。时至今日，仍然可以发现操作规程中诸多与国外不同之处，值得商榷。二、标准化制备血液采集到甘油化间隔。国内、外规定1-6天；国内个别血站用冰冻技术保存即将过期红细胞，冰冻红细胞质量难以保证。甘油化前红细胞压积（Hct）。国
2、外作为甘油添加量公式的重要参数；国内没有规定。甘油添加量。国外根据红细胞悬液重量，密度，压积参数，换算甘油添加量；国内统一按1U红细胞悬液添加160ml 57%甘油，添加量与国外相距甚远。为什么呢？甘油添加量与国外出入很大，见于下面求 解甘油添加量G的方程公式: （VRCC：红细胞悬液容量；Hct：红细胞悬液压积）国内(细胞外水+G)40%=G57%即(VRCC(1-Hct)G)40%=G57%国外(细胞外水+细胞内水+G)40%=G57%即(VRCC(1-Hct)VRCCHct0.72G)40%=G57%举例采集200ml全血，28ml CPDA抗凝，分离120ml血 浆。RCC添加50ml
3、 MAP，Hct 0.55VRCC=200+28-120+50=158ml150ml添加甘油量国内:（150（1-0.55）+G）40%=G57% G= 158.8ml国外： (150(1-0.55)+1500.550.72+G ) 40%=G57%G= 298.6ml国内仅考虑红细胞外水（血浆）容量，忽视大量存在的红细胞内水。国内公式结果甘油添加量偏低，甘油化红细胞的甘油终浓度将大大低于40%，严重影响红细胞冰冻保存效果。因为甘油添加量涉及红细胞悬液Hct，所以必须检测甘油化前红细胞Hct。洗涤液。国外使用12Nacl,0.9NaCl-0.2Glucose国内使用9Nacl，0.9NaCl；
4、缺乏当初选择9Nacl的实验数据支持。冰冻洗涤红细胞保存液。国外AS-1，AS-3等；国内0.9Nacl。ACP215 ACP215（国外） （国内）血液 1-6天的红细胞1-6天的红细胞/全血压积 755 * Hct?保护剂 57甘油 57甘油 保存 温度预温 预温 甘油量 机器换算* 160ml甘油/1 unit RBC滴加 速度0-70（泵速） 0-70（泵速）耗时 10-15分钟 10-15分钟终浓度 甘油40 * 甘油 ？Table1 甘油化方法比较Table2 去甘油化方法比较ACP215 （国外）ACP215 （国内）解冻慢速解冻，红细胞温度在30-34 度 慢速解冻，红细胞温度
5、控制？ *洗涤12Nacl， 0.9NaCl-0.2Glucose* 9Nacl，0.9NaCl保存液红细胞保存液（AS-3）* 0.9Nacl 耗时 50-60分钟 50-60分钟 三、质量控制CSBT规定了冰冻红细胞终产品的质控指标，包括红细胞回收率，白细胞残留量，血小板残留量，上清甘油残余量，体外溶血试验等。AABB还涉及中间产品的质量控制,如FT，FTW 。1、 概念freeze-thaw（FT）回收率。融化红细胞总HbFT= 100%融化红细胞总Hb总上清Hb反映甘油化，冰冻保存，融化冰晶对红 细胞损伤情况。freeze-thaw-wash（FTW）回收率。洗涤红细胞总HbFTW%=
6、 100%融化红细胞总Hb反映去甘油洗涤过程渗透压改变对红细胞影 响。2-134-46(gm%)甘油浓度 与 折光度 的相关性C. Robert Valeri, G. Ragno Transfusion and Apheresis Science 36 (2007) 1331372-234-46(gm%)甘油浓度 与 渗透压 的相关性C. Robert Valeri, G. Ragno Transfusion and Apheresis Science 36 (2007) 1331372-3融化后甘油化红细胞上清渗透压 与 上清血红蛋白浓 度的相关性C. Robert Valeri, G. R
7、agno Transfusion and Apheresis Science 36 (2007) 1331372-4融化后上清渗透压 与 红细胞冰冻-融化回收率 的相 关 性C. Robert Valeri, G. Ragno Transfusion and Apheresis Science 36 (2007) 133137The glycerol concentration can be estimated from the supernatant osmolality of the RBC following thawing but not from the supernatant re
8、fraction.融化过程甘油浓度可以由上清渗透压浓度估算 ，但不能由上清折光率(估算)。The supernatant osmolality also provides an accurate estimate of the percent hemolysis of the RBC following thawing.融化过程上清渗透压也可精确估算血红蛋白浓 度。C. Robert Valeri, G. Ragno Transfusion and Apheresis Science 36 (2007) 133137提示：利用渗透压，折光率与甘油浓度，血红蛋白浓度相关，制备标准曲线，用上清渗透
9、压数值精确估算冰冻前和融化后上清甘油浓度，上清血 红蛋白浓度，FT回收率，作为中间产品质控指标；用上清渗透压或折光率数值精确估算去甘油红细胞上清甘油残余量，作为终产品质控指标。 四、我们的工作针对制备工艺的标准化做了相关研究，主要解决两个问题：建立国际标准的制备工艺；验证9Nacl，0.9NaCl作为去甘油的梯度洗涤液，终产品能否符合质控要求。“Modify washing solutions in the process of deglycerolization in ACP 215 and storage at 4 in 0.9% sodium chloride in 24 h”Trans
10、fusion and Apheresis Science2010年第43卷第2期1. Material and methods分别从11名健康志愿者8男3女采集2单位全血 3500g离心10min，分离约200 mL血浆 AS-3保存红细胞6天 红细胞悬液1600g离心10min，处理成Hct 755% ACP215添加甘油1250g 离心10min，去除上清，处理成Hct 605% 装进纸盒，保存在-80机械冰箱，2056 d 冰冻红细胞放置36血浆融化箱10min，并轻轻摇动 80ml 9%Nacl盐水, 约1.6L 0.9%Nacl洗涤去甘油红细胞用0.9% Nacl保存液4 保存 24
11、hr 用自动计数仪检测总Hb浓度，用微细管血 沉法检测Hct总甘油浓度用次氯酸钠法上清Hb浓度用分光光度计法白细胞计数用Nageotte计数板法细胞外钾、钠离子用火焰光度计检测去甘油红细胞24hr后做细菌培养。37做需氧和厌氧培养7天。未作细胞染色。2. Results11例样本FT回收率是95.31.8%，FTW回收率是82.35.94%，甘油残余量是 6.11.66 mg/dl（Table 3）。洗涤后4 0.9% Nacl保存24hr，上清Hb是4313mg/dl, 溶血率是0.20.1%，上 清钾水平是4.030.81mM。洗涤后24hr需氧、厌氧培养均阴性。 Table 3 Qual
12、ity measures of RBCs afterthaw and postwash automatically prepared in ACP 215FT (%) FTW(%) glycerol residue (g/L)WBC residue (107)PLT residue (108)Mean95.382.3 6.1 1.432.31SD1.85.94 1.66 0.21 3.01N1111111111Table 4 In vitro measurements of deglycerolized RBCs prepared in ACP 215 and stored at 4in 0.
13、9 percent sodium chloride within 24 hoursAfter Thawed/washedHours storage at 4 in 0.9 percent Nacl4 81224 Supernatant Hb (mg/dl) Mean42 42 42 43 43 SD1214 12 15 12 N 11 11 11 11 11 Hemolysis (%) Mean0.20.20.20.20.2 SD 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 N 11 11 11 11 11 Supernatant K+ (mM) Mean0.781.442.97 3.54.03S
14、D0.420.540.460.670.81 N1111111111 Supernatant Na+ (mM) Mean157.72156.3155.1 154.99 154.45 SD1.38 1.631.72 1.22 0.91 N 11 11 11 11 113. Discussion去甘油程序9%Nacl替代12%Nacl可能增加红细胞细胞外渗透压下降速度。当细胞内外渗透压差 足够大时，超过细胞变形能力，红细胞就会被 破坏表现为溶血。使用9%Nacl和0.9%Nacl洗涤液，去甘油红细胞平均FTW值82.35.94，4保存24hr溶血率 0.20.1%，提示洗涤后红细胞质量影响非常小 。所有产品均符合CSBT和AABB标准。 五、展望使用ACP215标准化程序与国外同行增进交流，求同存异有问题吗？Question?
