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1、第十二章第十二章基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略转基因模型是研究基因功能的主要手段转基因模型是研究基因功能的主要手段zz转基因转基因生物：生物： yy外源基因导入生物体表达。外源基因导入生物体表达。 zz基因打靶基因打靶： yy外源基因替换内源基因。外源基因替换内源基因。 yy基因敲除。基因敲除。 yy基因敲入。基因敲入。 zz基因沉默基因沉默： yy导入特定基因，抑制内源性基因表达。导入特定基因，抑制内源性基因表达。第一节第一节 转基因技术转基因技术zz转基因技术转基因技术(transgenic technology)(transgenic technology)：将外将外 源基
2、因导入细胞，随机整合到受体基因组源基因导入细胞，随机整合到受体基因组 内，并随细胞分裂而遗传给后代。内，并随细胞分裂而遗传给后代。 yy细胞模型。细胞模型。 yy转基因动物。转基因动物。 yy转基因植物。转基因植物。一.转基因生物的意义z20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)：y著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白 基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达 。 zz转基因生物的用途：转基因生物的用途： yy研究手段：疾病的转基因动物模型。研究手段：疾病的转基因动物模型。 yy改良动物性状：抗病性、耐寒性等。改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 yy生产产品：抗体、疫苗等的生产
3、。生产产品：抗体、疫苗等的生产。二、基本原理二、基本原理zz构建携带目的基因的载体。构建携带目的基因的载体。 zz外源基因导入外源基因导入：将目的基因通过显微注射：将目的基因通过显微注射 等方法注入实验动物的受精卵或着床前的等方法注入实验动物的受精卵或着床前的 胚胎细胞中。胚胎细胞中。 zz使使目的基因整合目的基因整合到基因组中。到基因组中。 zz将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受 体动物的输卵管或子宫中。体动物的输卵管或子宫中。 zz使其发育成携带外源基因的转基因动物。使其发育成携带外源基因的转基因动物。基本原理基本原理供体基因供体基因受体的受精卵受体的
4、受精卵基本原理基本原理转基因的受精卵转基因的受精卵基本原理基本原理转基因动物转基因动物基本过程基本过程 上游上游基因改造和载体构建基因改造和载体构建 中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系 下游下游基因整合、表达的检测与细胞筛选基因整合、表达的检测与细胞筛选1. 1. 上游上游基因改造和载体构建基因改造和载体构建 外源基因外源基因: : 完整的转录单位完整的转录单位, , 由顺式作用元件、结由顺式作用元件、结 构基因和转录终止信号组成。构基因和转录终止信号组成。 报告基因报告基因 (reporter gene) : (reporter gene) : 在表达载体中引入易在表达
5、载体中引入易 于检测的提示重组体存在的基因。于检测的提示重组体存在的基因。GFPGFP、 LacZLacZ 、APAP、LUCLUC。 融合基因融合基因 (fusion gene): (fusion gene): 将特定的目的基因与报告将特定的目的基因与报告 基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成 完整的转录单位。完整的转录单位。动物转基因常用的载体动物转基因常用的载体zz腺病毒载体腺病毒载体 zz逆转录病毒载体逆转录病毒载体 zz非病毒类载体：如质粒等。非病毒类载体：如质粒等。2. 2. 中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系
6、基因导入技术：物理、化学和生物学方法基因导入技术：物理、化学和生物学方法1) 1) 显微注射法显微注射法 （microinjection)microinjection)2) 2) 胚胎干细胞法（胚胎干细胞法（embryonic stem cells, embryonic stem cells, ESES细胞）细胞）3) 3) 逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法4) 4) 精子载体法精子载体法1) DNA1) DNA显微注射法显微注射法zz制备超量受精卵。制备超量受精卵。 zzDNA DNA 显微注射。显微注射。zz转移注射卵到输卵管或子宫。转移注射卵到输卵管或子宫。 zz转基因鼠的鉴定及鼠系建立
7、。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。DNA DNA 显微注射显微注射持卵管持卵管DNADNA注射针注射针精原核精原核卵原核卵原核DNA DNA 显微注射显微注射zzDNA DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精显微注射到尚未发生核融合的受精 卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵 原核大，容易辨别。原核大，容易辨别。zz线性线性 DNA DNA 整合效率比超螺旋整合效率比超螺旋 DNA DNA 高出高出 数倍，因而用于显微注射的转入基因通常数倍，因而用于显微注射的转入基因通常 是去除载体序列的线状是去除载体序列的线状 DNADNA。DNA DNA 显微注射法的特点显微
8、注射法的特点 DNA DNA 大小无限制，最大可达大小无限制，最大可达 250Kb250Kb 。 随机整合：在染色体上整合的位点是随机整合：在染色体上整合的位点是 随机的，整合的拷贝数也不一定。随机的，整合的拷贝数也不一定。 转入的基因有可能碰巧整合到具有转入的基因有可能碰巧整合到具有 重要功能的基因之中，干扰该基因重要功能的基因之中，干扰该基因 的正常表达，影响转基因动物的正的正常表达，影响转基因动物的正 常发育和代谢。常发育和代谢。 总效率较低总效率较低( (实际成功率实际成功率1/1000)1/1000)。提高显微注射提高显微注射 DNA DNA 表达的成功率表达的成功率zz转入的外源基
9、因要能够高效表达，最好是转入的外源基因要能够高效表达，最好是 可以诱导表达。可以诱导表达。 zz转入基因中应该包含有帮助提高整合效率转入基因中应该包含有帮助提高整合效率 的序列，如微卫星序列。的序列，如微卫星序列。微卫星序列微卫星序列微卫星序列微卫星序列诱导表达诱导表达 启动子启动子外源基因外源基因2) 2) 胚胎干细胞法胚胎干细胞法zz胚胎干细胞胚胎干细胞(embryo stem cells, (embryo stem cells, ES ES 细胞细胞) )：yy可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎 细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚细胞，当把这种胚胎细胞
10、重新导入另一胚 泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其 他类型细胞的能力。他类型细胞的能力。 zzES ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和 分化特性。分化特性。胚胎干细胞法胚胎干细胞法zz分离和培养分离和培养 ES ES 细胞。细胞。 zz外源基因导入外源基因导入 ES ES 细胞。细胞。 zz导入外源基因的导入外源基因的 ES ES 细胞的子宫转移。细胞的子宫转移。zz转基因鼠的鉴定及鼠系建立。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞的分离和培养胚泡胚泡培养皿中分离培养皿中分离 胚泡内层细胞胚泡内层细
11、胞胰蛋白酶胰蛋白酶 消化解离消化解离加加饲养层细胞培养饲养层细胞培养胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞外源胚胎干细胞外源 DNA DNA 的导入的导入DNADNA胚胎干细胞胚胎干细胞囊胚囊胚 原囊胚原囊胚 转基因动物转基因动物磷酸钙磷酸钙-DNA -DNA 共沉淀法共沉淀法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法电穿孔法电穿孔法微注射微注射外源外源 DNA DNA 的整合的整合 用于用于 ES ES 细胞的细胞的 DNA DNA 载体一般带有定点载体一般带有定点 整合元件整合元件, , 避免了随机整合。避免了随机整合。 定点整合位点应选择在基因组内编码非必定点整
12、合位点应选择在基因组内编码非必 需产物的地方，以减少整合对细胞正常功需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。能的影响。 定点整合位点必须在基因组的可以进行转定点整合位点必须在基因组的可以进行转 录的地方。录的地方。胚胎干细胞法的特点胚胎干细胞法的特点 定点整合。定点整合。 ES ES 细胞在体外培养，外源细胞在体外培养，外源 DNA DNA 导入后可导入后可 用正用正- -负选择法筛选择正确整合的负选择法筛选择正确整合的 ES ES 细胞细胞 , , 相对较简单。相对较简单。 目前只在小鼠身上获得成功目前只在小鼠身上获得成功。3 3）逆转录病毒感染法）逆转录病毒感染法zz逆转录病毒载体
13、的构建逆转录病毒载体的构建 获得四获得四/ /八细胞胚胎八细胞胚胎/ /囊胚囊胚/ /原肠胚原肠胚 外源外源 DNA DNA 导入早期胚胎：导入早期胚胎：获得病毒颗粒感染早期胚胎获得病毒颗粒感染早期胚胎包装细胞与早期胚胎共培养包装细胞与早期胚胎共培养 感染后的胚胎植入受体动物子宫，发感染后的胚胎植入受体动物子宫，发 育成携带外源基因的动物。育成携带外源基因的动物。逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法外源基因外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒感染逆转录病毒感染四四/ /八细胞胚胎八细胞胚胎/ /囊胚囊胚/ /原肠胚原肠胚嵌合小鼠嵌合小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点逆转录病毒
14、感染法的特点zz通过病毒通过病毒 DNA DNA 插入宿主插入宿主 DNA DNA 的机制，将的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效外源目的基因整合到宿主基因组，整合效 率高。率高。zz反转录病毒载体容量有限，只能转移小片反转录病毒载体容量有限，只能转移小片 段段DNA(DNA(10kb)10kb)。zz对家禽类的转基因研究有重要意义。对家禽类的转基因研究有重要意义。4 4）精子载体法）精子载体法外源外源 DNADNA精子精子 卵细胞卵细胞 受精卵受精卵 转基因动转基因动 物物共育法共育法脂质体转染法脂质体转染法电穿孔法电穿孔法DNA精子精子受精卵受精卵DNADNA卵细胞卵细胞DNA
15、DNA胚胎干细胞胚胎干细胞DNADNA逆转录病毒感染逆转录病毒感染磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA共沉淀法共沉淀法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法电穿孔法电穿孔法四四细胞细胞 胚胎胚胎囊胚囊胚原肠胚原肠胚转转基因基因 动物动物微注射微注射显微注射显微注射3. 3. 下游下游基因整合与表达检测及筛选基因整合与表达检测及筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因以染色体基因水平：是否整合了外源基因以 及整合的位点和拷贝数。及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的转录水平：转基因的 mRNA mRNA 的存在与否的存在与否 以及表达水平。以及表达水平。 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功 能检测。能检测。鉴定方法鉴定方法 PCRPCR Southern blotSouthern blot 染色体原位杂交染色体原位杂交 Northern blotNorthern blot RT-PCRRT-PCR Western blotWestern blot基因转移鼠纯合鼠系的建立基因转移鼠纯合鼠系的建立 转基因杂合鼠转基因杂合鼠未未转基因转基因鼠鼠生殖系细胞中不生殖系细胞中不 含转入基因含转入基因生殖系细胞中含生殖系细胞中含 转入基因转入基因子代多次交配可得到纯合子代多次交配可得到纯合 转基因鼠系转基因鼠系三、转基因动物的应用
