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1、实 验 二 酶促反应动力学实验实 验 原 理1、酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可 调节性。v反应体系的条件必须严格控制。2、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的 化学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较 。v反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少 量来确定。3、酶催化反应的典型曲 线是随着时间的延长 ，反应速度下降，由 起初的直线变为曲线 。测定酶活性的所有反 应速率的比较都必须 依赖该曲线的线性部 分，因此要测定最初 反应速度，即底物浓 度变化在底物起始浓 度的5以内的速度 。SSV VVmaxVmax4、实验对象：碱性磷酸酶（AKP）磷酸苯
2、二钠碱性磷酸酶 苯酚磷酸氢二钠4-氨基安替比林K3Fe（CN）6醌衍生物（红色）碱性条件一、pH对酶促反应速度的影响v碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。二、温度对酶促反应速度的影响v碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37。三、底物浓度对酶促反应速度的 影响 碱性磷酸酶米氏常数的测定VmaxS Km + S 米-曼氏（Michaelis-Menten ）方程：V VmaxmaxV VSSKKmmV Vmaxmax/2 /2 Lineweaver-bulk（林贝氏方程）方程： + + 1/V=1/V=KKmmV Vmaxmax 1/V1/Vmax max 1/S 1/S 1/S 1/S 1/V
3、 1/V -Km KKmm/ /V Vmm 操作：1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1 ）（2 ）（3 ）（4 ）（5 ）（6 ）（7 ）（8 ）（9 ） 0.01 mol/L基质 液（ml）011111123蒸馏水（ml）376543220混匀。2、另取试管9支，做酶促反应：试剂管号123456789吸取上表稀释 基质液1ml（1 ）（2 ）（3 ）（4 ）（5 ）（6 ）（7 ）（8 ）（9 ） pH10碳酸钠 缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸
4、钠缓 冲液（ml）010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml， 充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及Km值求取1、在37C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放 的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。Av1
5、/v1/SKm？四、抑制剂对酶促反应的影 响抑制剂 无抑制剂 1/V 1/S 竞争性抑制作用抑制剂 1 / V 1/S 无抑制剂 非竞争性抑制抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂 反竞争性抑制实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。操作1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1 ）（2 ）（3 ）（4 ）（5 ）（6 ）（7 ）（8 ）（9 ） 0.01 mol/L基 质液（ml）011111123蒸馏水（ml）376543220混匀。2、另取试管9支，做酶促反应：试剂管号123456789吸取上表稀释 基质液1ml（1 ）（2 ）（3 ）（4 ）（5 ）（6 ）（7 ）（8 ）（9 ）0.04mol/L磷酸
6、氢二钠（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓 冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓 冲液（ml）010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml， 充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及Km值求取1、在37C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放 的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，并判断 该抑制剂属于何种类型。Av1/v1/SKm？ 该抑制剂为？注意事项：v配制的各种试剂及反应液必须混匀。v加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开 始。v加入酶液后要立即计时，计时要准确。v0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时 间不可过长。
