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1、酶类药物 -重组门冬酰胺酶表 达和制备 酶的分类门冬酰胺酶 L -天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解 生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通 常不能合成天门冬酸胺，L -天门冬酸胺酶将 阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。 在临床上，L -天门冬酰胺酶已广泛用于治疗 白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产， 国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产 品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产 品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产 成本。参 考 文 献1-重组与表达刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.大肠 杆菌L-天门冬酰胺酶基因的高效表达 中国药科大学生物化学教研室, 南京 210009南京铁
2、道医学院生物化学教研 室, 南京210009 2-提取与纯化 刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.大肠杆 菌L门冬酸胺酶的提取和纯化中国药 科大学生化教研室, 南京210009重组与表达材料限制酶 Ncol 、Hind III及T 4 DNA 连接 酶，购自 Promega 公司；Taq 酶、dNTP 、 IPTG 购自华美公司；丙烯酰胺、N , N -甲 叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma 公司。pKK 233 -2 购自clonetech 公司；pKK 233 - ansB 是将代PCR 扩增得到的AnsB 基因 DNA 用 Ncol 和Hind III消化后，定向插 入pKK 233 -2
3、的多克隆位点而得到的重组 质粒。 实 验 方 法PCR扩增AnsB基因重组质粒PKK233-ansB 的构建 阳性转化子的筛选PCR扩增AnsB基因 模板的制备：用接种环挑取CPU 210009菌体少许，在裂解液 (1 TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5 ,2mmol/L EDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于 PCR。 引物：E1:5-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC 一 3E2: 5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一3 11：5-GGCCATGGAGT111TCAAAAA
4、GACGCACTTGC一3 12 : 5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一3 扩增条件：84C变性1 min ; 60C复性2 min ; 72C延伸1 min ；循 环28次。重组质粒PKK233-ansB 的构建 PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233 -2 同时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼 脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消 化后的DNA 片段和电泳回收的质粒大片段 用T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖 凝胶电泳回收后转化HB 1 01 、71 / 15 、 ATCc 9637 、JM107 、cPU 210009
5、，筛 选获得相应的阳性转化子。阳性转化子的筛选 将涂布在含氨节青霉素的LB 平板上生长出 的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB 平板上，为每个克隆编号。平板置37C 温箱 中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0 . 1 mol/ L 硼 酸缓冲液（pH 8 . 4 ) 50ul的酶标板反应孔 内，待菌体分散后，每孔各加入0 . 04 mol / L 天门冬酞胺底物溶液50 ul , 37C 保温15 min ，加奈氏试剂50 ul，呈深棕红色孔内对 应的单菌落即为阳性转化子。条件选择酶的纯度 酶的浓度金属离子pH温度、时间晶种酶的分离纯化工作中的注意事项1. 防止酶
6、蛋白变性2. 防止复因子丢失3. 防止酶被蛋白水解酶降解提 取 纯 化蔗糖溶液提取法 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分 析） 酶活力的测定 酶分子量测定 提取纯化L-天门冬酰胺的提取（蔗 糖溶液提取法） 向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提 液（蔗糖40 ，溶菌酶 200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7.5.） 在30C震2小时，8000r/min离心 30min,收集上清酶液。L-天冬氨酸酶的纯化蔗糖溶液提取法获得的酶液, 加入硫酸铵至55 饱和度，调 pH至7.0, 室温搅拌1小时, 离心除去沉淀。上清液中加入硫酸 铵到90 饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、 pH7.
7、0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用 10mmol/L、pH7.6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层 析柱（1.030cm） 。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱, 流速为 40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于280处测定紫外吸收 值，绘制洗脱曲线（如图1）Ph4.8, 通过预先用 50mmol/L,pH4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素 层析柱（ 1.08.0cm）, 用50mmol/L、pH5.2 磷酸缓冲液洗脱, 收集显 示天门冬酞胺酶活力的组分, 冻干后得天门冬酰胺冻干粉。再 进行称量计算产量。 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析） 取适量样品加入1%NH4HCO3溶
8、解至1.0 mg/ml，按 130(W/W)加入胰蛋白酶，370.5保温16 h，50%冰醋酸 终止反应备用。色谱条件 流动相：A为0.1%TFA 水，B为 0.1%TFA，乙腈水(8020)。梯度：060 min，B：0 30%；60120 min，B：30%38%；120175，B：38% 80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 l；检测 波长：210 nm。 酶活力的测定 取004mol/L L-天门冬酰胺1 ml , 0 . 1 mol/ L pH8.4硼酸一 硼酸钠缓冲液lml，取酶液0 .2ml于试管中，于37C水浴保温 10min，加15 三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心 ，取上清液1ml,奈氏试剂2 ml和蒸馏水7 ml，放置15 min后于 500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L 一天门冬酰胺水解释放1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力 单位U。 1.3.7酶分子量测定 SDS-PAGE小组成员 演讲人-曹磊（0843613） 文献查阅-洪旭鹭（0843614）徐淑雅（0843616） PPT制作-方旭（0843615）谢谢大家！
