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1、第十五章 重组人干扰素生产工艺2010.4.12主要内容l干扰素概述l基因工程假单胞杆菌的构建与保藏l干扰素的发酵工艺过程l干扰素的分离纯化工艺过程1 .干扰素概述l干扰素的种类l干扰素的理化性质l干扰素的生物学活性l干扰素的临床应用l干扰素的生产工艺路线1.1 干扰素的种类l概念: (interferon,IFN)干扰素是一种细胞因子,它是机体感染病毒时,宿主细胞 通过抗病毒应答反应,而产生的一组结构类似、功能相近 的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon,简称IFN。l发现:干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭 活的流感病毒作用于小鸡细胞,结果发现这些细胞产生了
2、 一种可溶性物质,这种物质能抑制流感病毒,并且能干扰 其它病毒的繁殖,因此,他们将这种物质称为“干扰素” 。以后科学家们进一步发现,机体对入侵的异种核酸(包 括病毒)都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒 感染时,机体细胞产生干扰素,干扰病毒复制,它是机体 抗病毒感染的防御系统。 天然干扰素分类1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素: IFN、IFN、IFN 、IFN 来源:白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能 :抗病毒感染、抗肿瘤生长免疫调节(较弱) 其中IFN-为多基因产物,有23种以上的亚型。II 型干扰素:干扰素(IFN)来源:活化的T细胞和NK细胞产生功能:
3、免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成,下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用(次要) 2. 根据动物来源确定分类,例如人干扰素(HuIFN),小鼠干扰素(MuIFN )。l上市重组干扰素: 2a、2b、1b、 1b,1992年我国第一个基因工程药物IFN-1b获得 国家一类新药证书。l研发中的重组干扰素:IFN ,临床阶段1.2干扰素的理化性质143-166aa;MW:18-40 ku;pI: 6.5-7.5;乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。型干扰素具有广谱的抗病毒活性,对多种病毒如
4、DNA病毒和RNA病 毒均有抑制作用;但这种效应不是直接的,而是通过对宿主细胞的作 用引起的。 对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体,核内有“抗病毒蛋白”基因 ,受干扰素作用后该基因活化,产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA 翻译,并促进病毒mRNA降解。 干扰素能提高细胞表面MHC类分子的表达水平,受到病毒感染的细 胞表面MHC类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原,引起靶细胞 的溶解。 干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。1.3干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素,只有在某些特定因素的作 用下才能诱使细胞产生干扰素。1.3.1广谱抗病毒活性机制病毒复制抑制病 毒复制信号转
5、导IFN-aIFN-诱导蛋白 诱导刺激胞核 胞核 抗肿瘤作用机制型干扰素能抑制细胞的型干扰素能抑制细胞的DNADNA合成,减慢细胞合成,减慢细胞的有丝分裂速度;这种抑制作用有明显的选择的有丝分裂速度;这种抑制作用有明显的选择性,对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强性,对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强50050010001000倍。另外,倍。另外,型干扰素也可通过增型干扰素也可通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应。抗肿瘤效应。免疫调节活性机制免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响,如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细 胞等均有一
6、定作用。l对巨噬细胞的作用:IFN可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加,增强其抗原递 呈能力;此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体,促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗 体包被的病原体和肿瘤细胞。l对淋巴细胞的作用:干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂,可受剂量和时间等因素的影 响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入 会产生明显的免疫抑制作用;而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生 免疫增强的效果。在适宜的条件下,IFN对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用, 但不能促进其增殖。IFN能增强TH1细胞的活性,增强细胞免疫功能;但对TH2细胞的 增殖有抑制作
7、用,因此抑制体液免疫功能。IFN不仅抑制TH2细胞产生IL-4,而且抑制 IL-4对B细胞的作用,特别是抑制B细胞生成IgE。l对其它细胞的作用:IFN对其他细胞也有广泛影响:刺激中性粒细胞,增强其吞噬 能力;活化NK细胞,增强其细胞毒作用;使某些正常不表达MHC类分子的细胞 (如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHC类分子,发挥抗原递 呈作用;使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强,且可分化为高内皮静脉, 吸引循环的淋巴细胞。1.4 重组干扰素的临床应用l广谱抗病毒活性(rhuIFN)慢性乙型、丙型、丁型肝炎;疱疹、病毒性角 膜炎。l直接抗肿瘤活性(rhuIFN)毛细胞和慢性
8、髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍 奇金淋巴瘤。l免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤( rhuIFN)l多发性硬化症 rhuIFN1.5.干扰素生产工艺路线(1 )体外诱生干扰素制备工艺:l Sendai病毒诱导人白细胞l1989年:IFN-n3/Alferon,批准上市l产量低:1g IFN,需要 3亿ml人血白细胞l来源困难,工艺复杂,收率低,价格昂贵l潜在的血源性病毒污染的可能性干扰素生产工艺路线(2 )人源转化细胞系培养生产工艺:l 1999年:IFN -n1/Wellferon, 批准用于临床。l 优点:首次实现大规模商业化生产。l 缺点: 活性低,退出临床应用。干扰素生产工艺路线(3
9、)上市产品:重组人干扰素rhuIFN1986,rhuIFN-2a, rhuIFN-2b;1990,rhuIFN-1b;1993,rhuIFN-1b;20012002: PEG化IFN,PEG-Intron, Pegasys表达产物:无糖基化,N-met,无活性包涵体 工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:干扰素生产工艺路线(4 )l上市产品:rhuIFN -1al1996, Avonex(Biogen);2002, Rebif(Serono)l表达产物:166 aa 糖基化蛋白,22.5 kul工艺特点:分泌表达,产量低,成本高,过程 严格动物无限细胞系培养生产
10、工艺:干扰素生产工艺路线(5 )宿主:腐生型假单胞杆菌(Pseudomonas putida) 上市产品:IFN -2b/安福隆 表达产物:无糖基化可溶性蛋白质,具有天然分子结构和生物活性 工艺特点: 发酵周期短:几个小时 无需变性、复性过程,获得有活性产品 纯化过程:淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺2. 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏l基因工程假单胞杆菌菌种建立l基因工程假单胞杆菌菌种特性l菌种库的建立与保藏2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立l第一步:干扰素-2b基因的克隆l第二步:表达载体的构建l第三步:工程菌的构建第一步:干扰素基因的克隆(RT-PCR)l制备白细胞,病毒诱
11、导,分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR ,l基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。l测序:编码人IFN-2b基因序列,501bp,165aa。第二步:表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体第三步:工程菌构建l转化假单胞杆l筛选高表达、稳定遗传的工程菌l获得原始菌种2.2基因工程菌的特性(1)具有宿主菌的特征:细菌:革兰氏阴性菌,有荚膜,无芽孢,杆状 。 菌落:直径2.5-3.0 mm,灰绿色半透明状,粘稠 。生化特性:Ser-,L-Val、D/L-Arg和L-Thr为 (2)工程菌的特征:SmR、TcR、ApR (3)具有生产干
12、扰素能力: 放射性免疫学效价不低于2.0109 IU/L。2.3 菌种库的建立与保藏 QC:菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后,方可投产。3 .干扰素-2b的发酵工艺过程3.1摇瓶培养l取保存工作种子批菌种,室温融化l摇瓶培养:30,pH7.0,250 r/min,182hl检测:OD值和发酵液杂菌检查。3.2 种子罐培养p 接种:接入50L种子罐,接种量10%。p 培养:30,pH7.0。p 控制:级联调节通气量和搅拌转速DO为30%,34h,OD4.0。p 检测:显微镜和LB培养基划线检查,控制杂 菌。3.3 发酵罐培养u接种:通入300L培养基的发酵罐,接种量10%。u控制:
13、级联调节通气量和搅拌转速。u前4h:30,pH7.0,DO为30%。u4h后:20,pH6.0,DO为60%,56.5h。u终点控制:OD值达9.01.0,5冷却水快速降温至 15以下。u检测:发酵液杂菌检查3.4菌体收集l连续流离心机:冷却的发酵液,16000 r/min 离心收集。l菌体保存:20冰柜,不超过12个月。l检测:干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥 失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。4 干扰素的分离纯化工艺过程4.1、干扰素分离工艺过程4.2、干扰素的纯化工艺过程4.1 干扰素-2b分离工艺过程l菌体裂解l预处理l初级分离(1)菌体裂解l裂解缓冲液:纯化水配制,210( pH7
14、.5)l使用保护剂:EDTA,PMSF。l破碎20菌体:2厘米以下的碎块l搅拌:加裂解缓冲液,210,2hrl冻融: 细胞完全破裂,释放干扰素。(2)预处理-沉淀l加絮凝剂聚乙烯亚胺:210,搅拌45min,对菌体碎片进行絮凝。l加凝聚剂醋酸钙溶液:210,搅拌15min,对菌体碎片、DNA等进行沉淀。(3)离心l连续流离心机:210,16000 r/minl收集上清液:含有重组干扰素蛋白质l杂质沉淀:121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理 。(4)初级分离l盐析: 4M硫酸铵,210,搅匀,静置过夜 。l离心:连续流离心机,16000 r/minl保存:收集沉淀,粗干扰素,4保存。4.2、干
15、扰素纯化工艺过程l溶解粗干扰素l沉淀与疏水层析l阴离子交换层析与浓缩l阳离子交换层析与浓缩l凝胶过滤层析l无菌过滤分装(1) 溶解粗干扰素l配制纯化缓冲液:超纯水,pH7.5磷酸缓冲液,0.45 m滤器和 10 ku超滤系统,百级层流下收集。冷却至2 10。l检查: 缓冲液的pH值和电导值。l溶解:210,匀浆,完全溶解。(2) 沉淀与疏水层析l等电点沉淀(1):磷酸调节至pH5.0,沉淀杂 蛋白,离心收集上清液。l疏水层析:干扰素吸附在疏水层析柱中除非疏水性蛋白l洗脱与收集:0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)。l等电点沉淀(2):磷酸调节pH4.5,调节电导 值40 ms/cm,210,静置
16、过夜l超滤:1000 ku超滤膜过滤,除去大蛋白。l透析除盐:调整溶液pH 8.0,电导值,10 ku 超滤膜,0.005 M缓冲液。(3)阴离子交换层析与浓缩l0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂。l盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱,l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩:调整溶液和电导,10 ku超滤膜,0.05M 醋酸缓冲液(pH5.0)中透析。(4)阳离子交换层析与浓缩l用0.1M醋酸缓冲液(pH 5.0)平衡树脂。l上样,相同缓冲液冲洗。l盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩:10 ku超滤膜进行。(5)凝胶过滤层析l洗涤液:0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液( pH7.0)清洗系统和树脂l上样,