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1、目录基因重组和基因工程基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering目录DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外 重组DNA的分子克隆1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的 化学裂解DNA测序问世不久，Sanger 等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP)重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology)目录自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的 DNA Recombinat
2、ion and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录DNA-遗传物质n保守性-保持物种的稳定n变异性-突变是自然界经常发生的，而且 是生物进化的基础。n流动性-自然界中不同物种或个体之间的 DNA重组和基因转移是经常发生的，同 时是基因变异、物种演变、生物进化的 基础。目录DNA重组接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)转 座 (transposition)同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组(site-specific reco
3、mbination)目录n自然界发生的DNA重组增加了群体的遗传多样性n通过优化组合，积累了有意义的遗传信息n参与了许多的重要的生物学过程目录 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式目录nHolliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(pa
4、tch recombinant)拼接重组体(splice recombinant) 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接，形成Holliday中间体； 通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为：目录 片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 内切酶(recBCD) DNA侵扰 (recA)分支迁移(recA)内切酶 (recBCD)D
5、NA连接酶535 35353535353 53535353 535 3533353 5335535353Holiday中间体535353 53Holiday中间体535353 5355 355333355553333555 5333555 5333355553333内切酶 (ruvC)内切酶 (ruvC)DNA 连接酶DNA 连接酶片段重组体拼接重组体目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。目录 可接合质粒如 F 因子(F factor) 细
6、菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 质粒目录（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。目录例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录噬菌体的生活史溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)目录三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合 位点特异重组(site-spe
7、cific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。目录噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）噬菌体DNA的整合目录（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。目录hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白
8、基因。目录H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。 轻链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RS
9、S)。此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOH OHVJ单链切开RAG1 RAG2分子内转酯反应单链切开 转移核苷酸 修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目录四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和
10、转座子。 目录 插入序列(insertion sequences, IS)组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因目录 插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)插入序列的复制性转座目录 转座子(transposons) 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因（二）转座
11、子转座 转座子组成： 反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因目录细菌的可流动性元件A 插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B 转座子Tn3：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C 转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录由转座子介导的转座目录第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.A
12、very的肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录相关概念n DNA克隆n 工具酶n 目的基因n 基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系本节主要内容：目录一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。（一） DNA克隆目录 技术水
13、平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆） 细胞克隆个体克隆（动物或植物） 目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有自我复制能力的DNA分子复制子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆目录 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋
14、白质） 基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚
15、合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进 行分子生物学研究中常用的工具酶。 目录限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bam H 定义：目录与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用型） 分类： 作用：目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第
