《液相色谱原理与方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《液相色谱原理与方法（356页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、SHIMADZUSolutions for Science Since 1875 液相色谱原理与方法分离原理检测原理HPLC 技巧HPLC 检定和认证方法开发与验证1SHIMADZUSolutions for Science Since 1875 液相色谱分离原理液固（吸附）色谱液液（分配）色谱键合相色谱 正相色谱反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱空间排阻色谱亲和色谱液相色谱分类2SHIMADZUSolutions for Science Since 1875 吸附色谱分离机理：化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸 附，是物理吸附（表面吸附）。流动相分 子和样品分子竞争性吸附在固定相的特
2、定 位点上，该吸附是可逆的。吸附色谱固定相极性 酸性（硅胶）碱性（氧化镁、硅酸镁分子筛、三氧化二铝等）非极性（活性炭）3SHIMADZUSolutions for Science Since 1875吸附色谱流动相常使用烷烃为底剂，加入适当的极性 调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大。注意：不能使用含水的流动相，因为硅胶遇 水会失活。（微量水可改善拖尾状况，有 时用水作减尾剂）吸附色谱4SHIMADZUSolutions for Science Since 1875 吸附色谱的分离机理 随着样品在固定相 上的吸附能力由大 到小 在色谱柱上的保留 由长到短5SHIMADZUSolutions fo
3、r Science Since 1875分离物质对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离 ，例如油品、脂肪、芳烃等对具有不同极性取代基的化合物或异构体有 较好的选择性但对于强极性或离子型的化合物会产生不可 逆吸附。对同系物分离能力较差 优点：样品负载能力大稳定性好（pH38）吸附色谱6SHIMADZUSolutions for Science Since 1875液液分配色谱分离原理被分离的组分在流动相和固定相中的溶 解度不同进行分离。该过程是一个分配 平衡过程。 固定相：惰性载体（担体）上机械涂布固定液固定液容易流失，导致保留值减小，柱效下降 。 化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相7S
4、HIMADZUSolutions for Science Since 1875分配色谱的分离机理8SHIMADZUSolutions for Science Since 18751、稳定性正相键合相的稳定性要小于反相键合相反相键合相使用PH为27.5，PH7.5会引起基体硅胶溶解 2、重现性同一种类型的键合相，因厂家不同、生产批号不同，会表现不同的分离特性，表现为重复性差 3、键合相色谱柱的再生吸附、缔合等作用使柱效降低正相色谱柱再生： 1:1甲醇-氯仿反相色谱柱再生：甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、0.01mol/L 无机酸（硫酸pH2）键合相色谱键合相使用的注意点9SHIMADZUSolutio
5、ns for Science Since 1875键合相色谱流动相的选择质子受体质子供体偶极化合 物甲醇乙腈THF乙醚CHCl 3CH2Cl2正相色谱反相色谱水正相、反相色谱中溶剂选择性示意图10SHIMADZUSolutions for Science Since 1875键合相色谱正相色谱正相液相色谱 流动相极性小于固定相极性分离机制：范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作 用力。氢键力是主要的作用力。固定相：键合的氨基（NH2)、腈基（CN)、醚基（O） 等氢键力：氨基 腈基 芳硝基 二醇基 醚基流动相：常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极 性越大，洗脱能力越大。适用范围
6、：不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体拆分和制备液相。11SHIMADZUSolutions for Science Since 1875氨基柱：极性强，具有碱性。可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂，分离酚、羧酸 、核苷酸等类物质。与糖分子中的羟基作用，可分离单糖、二糖、多糖。注意：氨基柱不能分析含有羰基的化合物（如醛、酮、还 原糖等，流动相不能用丙酮）键合相色谱正相色谱12SHIMADZUSolutions for Science Since 1875腈基柱：中等极性，分离选择性与硅胶类似，但 保留值比硅胶低。对酸性、碱性样品可获得对称峰。对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分 离能力。
7、芳硝基柱：弱极性对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性键合相色谱正相液相色谱13SHIMADZUSolutions for Science Since 1875二醇基柱：弱极性可分离有机酸及其共聚物。也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相醚基柱：弱极性可分离能形成氢键的化合物，如酚类和硝基化合 物也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相键合相色谱正相液相色谱14SHIMADZUSolutions for Science Since 1875HPLC 的正相柱硅胶基底 : 常用氰基 : 常用氨基 : 分析糖二醇基柱: 分析蛋白质硅胶Si Si-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2
8、CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)修饰后的Si15SHIMADZUSolutions for Science Since 1875相互作用力是什么?OHHOSiOHSiOH强强弱弱or非常弱非常弱氢键氢键16SHIMADZUSolutions for Science Since 1875氢键力 如果样品有 -COOH : 羧基 -NH2 : 氨基 -OH : 羟基 氢键力变强. 如果样品没有任何官能团，如碳水化合物 如果样品有大的基团, 由于空间障碍 氢键力变弱.17SHIMADZUSolutions for Science Since 1875正相模式
9、下流动相的选择v主要试剂 v 烷烃 （戊烷、己烷、庚烷、辛烷） v 芳香烃 （苯、甲苯、二甲苯） v 二氯甲烷 v 氯仿 v 四氯化碳v 辅助试剂 v 甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氢呋喃(THF)，二氧杂 环乙烷， 嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助 试剂。18SHIMADZUSolutions for Science Since 1875增加溶剂极性0 % 2 % 5% / 0 % 2 % 5% / MeOHMeOH 1 : 邻苯二甲酸二辛酯 2 : 邻苯二甲酸二丁酯 3 : 邻苯二甲酸二乙酯 4 : 邻苯二甲酸二甲酯 溶
10、剂 : 己烷19SHIMADZUSolutions for Science Since 1875反相液相色谱反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性分离机制：疏水性键合相色谱反相色谱20SHIMADZUSolutions for Science Since 1875反相液相色谱反相液相色谱固定相：键合的烷基或苯基等非极性固定相固定相：键合的烷基或苯基等非极性固定相流动相：水、有机溶剂、缓冲液等极性溶剂流动相：水、有机溶剂、缓冲液等极性溶剂键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值增大流动相流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强， 溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质与键合相的作用越
11、强，流动相的洗脱能力越差， 溶质保留值越大。溶质保留值越大。溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。 键合相色谱反相液相色谱21SHIMADZUSolutions for Science Since 1875分离物质：能溶于水/有机溶剂混合液的中性或非离子 化合物烷基柱（C8、C18）可分离中等极性的化合物，溶于水的高极性化合物 ，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核 碱、核苷、核苷酸、极性合成药物等苯基柱（C6H5)：可分离非极性至中等极性的化合物，如：脂肪酸、甘 油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性 维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生化氨基酸 等键合相色谱反相液相色谱2
12、2SHIMADZUSolutions for Science Since 1875HPLC反相柱 C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type-Si-C18H37Si非极性非极性23SHIMADZUSolutions for Science Since 1875相互作用力是什么?OHOHC18 (ODS) 强弱疏水性疏水性 相互作用相互作用24SHIMADZUSolutions for Science Since 1875疏水性 如果样品有 CH3CH2CH2- : 碳链 : 芳香基
13、 如果样品有 -COOH : 羧基 -NH2 : 氨基 -OH : 羟基疏水力变强疏水力变强疏水力变弱疏水力变弱25SHIMADZUSolutions for Science Since 1875反相模式下流动相溶剂的选择 水 (缓冲液) + 有机溶剂 在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和PH是 非常重要的 甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂 优化水（缓冲液）和有机溶剂的比例是非常 重要的26SHIMADZUSolutions for Science Since 1875溶剂极性降低对分离的影响 20 % 30 % 40% / 20 % 30 % 40% / H2OH2O1 : p-Hyd
14、oxymethylbenzoate 2 : p-Hydoxyethylbenzoate 3 : p-Hydoxypropylbenzoate 4 : p-Hydoxybutylbenzoate有机流动相: MeOH27SHIMADZUSolutions for Science Since 1875固定相的影响C18 (ODS) 强C8样品样品样品C4媒介弱28SHIMADZUSolutions for Science Since 1875固定相的影响u分析条件v柱 : Shim-pack CLC-ODSv流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 v流速 : 1.0 mL/minv温度 :
15、 40 Cv进样体积 : 10 uLv检测器 : UV-254 nmu峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-丙基 苯甲酸 4. n- 丁基 苯甲酸ODS C8 TMS ODS C8 TMS 29SHIMADZUSolutions for Science Since 1875 反相 保留时间重复性好 固定相耐用 正相 对立体异构体有很好的分 离(Vitamin E 等) 保留时间有变化 反相模式与正相模式的对比反相模式与正相模式的对比30SHIMADZUSolutions for Science Since 1875离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种（或数种）与 溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反 离子）加到流动相或固定相中，使其与溶 质离子结合形成离子对，从而控制溶质离 子保留行为的一种色谱法。关于离子对色 谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种 机理：离子对形成机理；离子交换机理； 离子相互作用机理。键合相色谱离子对色谱31SHIMADZUSolutions for Science Since 1875键合相色谱离子对色谱v阴离子化合物 氢氧化四丁基铵 溴化四丁基铵v阳离子化合物
