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1、实验三 细菌染色及形态观察 1.1 掌握革兰氏染色和芽胞染色的原理和方法。 1.2 巩固无菌操作技术 。 1.3 掌握显微镜油镜使用的方法。 1.4 初步掌握微生物学绘图方法。 1 实验目的2.1 观察微生物细胞时,为什么要对微生物进行染色?革兰氏染 色与细菌细胞壁的结构与成分有什么关系?芽胞染色的机理是 什么? 2.2 显微镜油镜为什么能增加照明亮度?,为什么能增加分辨率 ?2 实验原理(通过了解下列问题来掌握实验原理)革兰氏染色法芽胞染色法3 材料与方法3.1.1 药品:革兰氏染色液:草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液 、95%乙醇、番红染液,无菌生理盐水。芽胞染色液:孔雀绿染色液,番红染色液3
2、.1.2 菌种: Escherichia coli(大肠杆菌)、 Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)培养18-24 h菌落平板, Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)培养24 h菌落平板。3.1.3 仪器:显微镜(MODEL E100)3.1.4 其它物品:载玻片,镜油,二甲苯,擦镜纸,接种环, 酒精灯等。3.1 实验器材3.2 方法 A. 革兰氏染色法3.2.1 制片。涂片:取一洁净载片,用记号笔从中分成两个区域, 在两区中央各滴一小滴生理盐水,按无菌操作要求用接种环取平 板菌落边缘的菌体少许,置于生理盐水中涂抹成约1.5 cm均匀薄 膜;
3、干燥:自然干燥(或电吹风干燥);固定:将涂面朝上,通过 火焰23次。(教师示范)3.2.2 初染。滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色12min 后倾去染液,水洗。(教师示范)3.2.3 媒染。先用卢戈氏碘液冲去载片上残留水迹,再用碘液 覆盖1 min,水洗。3.2.4 脱色。滴加95%乙醇脱色2030s ,立即水洗。3.2.5 复染。用吸水纸吸去载片上残留水,用番红复染液染色2 min,水洗,吸干水迹。3.2 方法 B. 芽胞染色法3.2.1 制片:按革兰氏染色方法操作。(取菌落中央和边缘的菌体)3.2.2 染色。用试管夹夹住载片,滴加孔雀绿染液35滴于涂菌 部位,置酒精灯火焰上加热58
4、min ,加热过程要随时滴加染色 液,防止煮沸或干涸。3.2.3 水洗:载片冷却后水洗。3.2.4 复染。用番红染色液染色1 min 。水洗,干燥。3.2 方法 C. 细菌形态观察低倍镜观察 4,10 高倍镜观察 (40,找到合适观察目标,移至视野中心)油镜观察(100) 将高倍镜转离工作位置,在要观察的涂菌部位滴加一滴 镜油,将油镜转至工作位置,聚光器升至最高,调节照明 度,调节细调节器,使物像清晰。绘图 在所观察的图像中选取典型部位绘图,要求左眼观察图像, 右眼观察绘图;球菌应注意长度与直径之比,球菌应注意排 列状况;有芽胞的细菌应标记芽胞和营养体的位置;图下方 应标明图的名称、放大倍数、染色结果。实验报告1 用文字描述实验项目、实验目的、材料与方法.2实验结果。按绘图要求进行。3 实验分析。分析革兰氏染色、芽胞染色的过程和 结果?分析显微镜使用中存在的问题?应如何改 进?