高效液相色谱法新

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1、 第第1010章章 高效液相色谱法高效液相色谱法13.1 HPLC13.1 HPLC概述概述 13.2 HPLC13.2 HPLC分类与基本原理分类与基本原理 13.3 13.3 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法 13.4 13.4 固定相固定相 13.5 13.5 流动相流动相 13.6 13.6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 13.7 13.7 定性、定量分析方法定性、定量分析方法 13.8 13.8 应用与示例应用与示例13.1 HPLC13.1 HPLC概述概述1. 1. 基本概念与特点基本概念与特点 2. 2. HPLCHPLC与经典与经典LCLC的比较的比较 3. HPLC3.

2、 HPLC仪器结构仪器结构13.1 HPLC13.1 HPLC概述概述概念：高效液相色谱法是在概念：高效液相色谱法是在2020世纪世纪6060年代末，以经典年代末，以经典 液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上 采用了采用了高效固定相、高压输液泵高效固定相、高压输液泵和和高灵敏度在线检测高灵敏度在线检测 器器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。，从而发展起来的一种新型分离分析技术。特点：适范围广、分离性能好、分析速度快、流动相特点：适范围广、分离性能好、分析速度快、流动相 可选择范围宽、灵敏度高、操作自动化等。可选择范围宽、灵敏度高、操作

3、自动化等。1. 基本概念与特点 2. HPLC与经典LC的比较 3. HPLC仪器结构13.1 HPLC13.1 HPLC概述概述HPLCHPLC与经典与经典LCLC的比较一览表的比较一览表经典液相色谱经典液相色谱 高效液相色谱高效液相色谱 常压或减压常压或减压高压，高压，404050MPa50MPa填料颗粒大填料颗粒大填料颗粒小，填料颗粒小，2 250m50m柱效低柱效低柱效高柱效高,40000,400006000060000块块/m/m分析速度慢分析速度慢分析速度快分析速度快色谱柱只用一次色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用色谱柱可重复多次使用不能在线检测不能在线检测能在线检测能在线检测1.

4、 基本概念与特点 2. HPLC与经典LC的比较 3. HPLC仪器结构13.1 HPLC13.1 HPLC概述概述HPLCHPLC仪器结构示意图仪器结构示意图1. 基本概念与特点 2. HPLC与经典LC的比较 3. HPLC仪器结构13.2 HPLC13.2 HPLC分类与基本原理分类与基本原理 化合物的极性、电荷、分 子大小、旋光性四种主要 性质，化合物这些性质的 差异是引起高效液相色谱 分离本质性原因，对应着 分配色谱、离子交换色谱 、空间排阻色谱、手性色 谱等分离方法。1. 方法分类 2. 基本原理13.2 13.2 方法分类与基本原理方法分类与基本原理HPLCHPLC与与GCGC在

5、基本原理、概念和方法基本上相同，在基本原理、概念和方法基本上相同， 主要差别是流动相的性质不同。因此，某些公式的主要差别是流动相的性质不同。因此，某些公式的 表现形式或参数的含意有些差别。表现形式或参数的含意有些差别。 (1) HPLC(1) HPLC中的中的van Deemtervan Deemter方程表现形式：方程表现形式：H H= =A A+ +CuCu1. 方法分类 2. 基本原理13.2 HPLC13.2 HPLC分类与基本原理分类与基本原理314 5uHPLCGCH2图10-2 流动相的流速对GC 与HPLC柱效影响对比(2) HPLC(2) HPLC中涡流扩散和传质阻力对柱效的

6、影响中涡流扩散和传质阻力对柱效的影响1. 方法分类 2. 基本原理13.2 HPLC13.2 HPLC分类与基本原理分类与基本原理(3) HPLC(3) HPLC分离条件选择分离条件选择 采用小颗粒、窄粒度分布的球形固定相、首选化学采用小颗粒、窄粒度分布的球形固定相、首选化学 键合相，匀浆法装柱；键合相，匀浆法装柱； 采用低黏度流动相、低流速采用低黏度流动相、低流速(1mL/min)(1mL/min)； 柱温保持在柱温保持在25-3025-30为宜。为宜。1. 方法分类 2. 基本原理13.3 13.3 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法13.3.1 13.3.1 液液- -固吸附色谱法固吸

7、附色谱法 13.3.2 13.3.2 液液- -液分配色谱法液分配色谱法 13.3.3 13.3.3 化学键合色谱法化学键合色谱法 13.3.4 13.3.4 其他色谱法其他色谱法13.3 各类高效液相色谱法 13.3.1 液-固吸附色谱法1.分离机理吸附色谱法是被分离的组分分子与流动相分子争夺吸 附剂表面活性中心，靠组分分子的吸附系数的差异而 分离。在吸附色谱中，选择使用条件使组分间的分配系数K 产生差别，以达到分离的目的。由于表面积S不易测 ，而k=KS/Vm，因此常用k代替K来填料问题。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.1 液-固吸附色谱法2.影响容量因子的因素 以硅胶吸附剂为例

8、(1) 硅胶的活性 硅胶必须保持干燥，遇水会失活，烘干 可再生。使用硅胶柱进行色谱分离时，必须使用不含 水的流动相。硅胶活性越大，k越大，tR越长。 (2) 溶剂的极性 与硅胶吸附剂配套的流动相，是以烷烃 为底剂加适当极性调整剂，组成二元或多元溶剂系统 。溶剂的极性越大，k越小，tR越短。 (3) 容量因子序 组分的极性越大，在硅胶吸附剂表面的 保留作用(亲和力)就越强， k越大，tR越长。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.2 液-液分配色谱法1.分离机理：分配色谱法是由于样品组分溶入固定相 与 流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。不同 组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大(K、

9、k差 别也大)分离效果越好。n正相液-液色谱法：极性：流动相固定相。极性小 的组分先出峰、极性大的组分后出峰。n反相液-液色谱法：极性：流动相固定相。极性大 的组分先出峰、极性小的组分后出峰。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法将固定液的官能团键合在载体的表面就构成了化学键将固定液的官能团键合在载体的表面就构成了化学键 合相，以此为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法合相，以此为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法 (bonded phase chromatography(bonded phase chromatography，BPC)BPC)。化学键合相既有分配作用，又有

10、吸附作用，应用广泛化学键合相既有分配作用，又有吸附作用，应用广泛硅胶内部十八烷基硅烷 键合相 ODS硅胶表面硅胶内部13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法1.1.正相键合相色谱法正相键合相色谱法2.2.反相键合相色谱法反相键合相色谱法3.3.离子对色谱法离子对色谱法4.4.离子抑制色谱法离子抑制色谱法13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法1.正相键合相色谱法固定相：极性大的化学键合相，如氰基、氨基化学 键合相；流动相：极性小的烷烃(正己烷)加适量极性 调整剂构成。分离机理 主要靠范德华力(定向、诱导)或氢键作 用力的差别而分离。流动相的极性与容量因子

11、的关系 流动相极性增大 ，洗脱能力增加，k减小、tR减小。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法2.2.反相键合相色谱法反相键合相色谱法 RBPCRBPC典型的典型的RBPCRBPC：非极性键合固定相极性流动相组：非极性键合固定相极性流动相组 成。固定相：成。固定相：ODSODS；流动相：甲醇；流动相：甲醇- -水，乙腈水，乙腈- -水。水。 非典型非典型RBPCRBPC：弱极性或中等极性键合相极性大：弱极性或中等极性键合相极性大 于固定相的流动相组成。于固定相的流动相组成。分离机理分离机理 疏溶剂理论、双保留理论、顶替吸附疏溶剂理论、双保留理论、顶替吸附- - 液相相互

12、作用模型等。液相相互作用模型等。流动相的极性与容量因子的关系流动相的极性与容量因子的关系 流动相的极性增流动相的极性增 大，对组分的洗脱能力降低，大，对组分的洗脱能力降低， k增大、tR增大；反 之， k减小、tR减小。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法3.3.离子对色谱法离子对色谱法 有正相、反相之分，常用反相的有正相、反相之分，常用反相的 。反相离子对色谱法：由于离子型化合物在非极性固反相离子对色谱法：由于离子型化合物在非极性固 定相中的溶解度很小，几乎没有保留作用。为此，定相中的溶解度很小，几乎没有保留作用。为此， 加入与其带相反电荷的离子对试剂，生成不荷电的加

13、入与其带相反电荷的离子对试剂，生成不荷电的 中性离子对，而中性离子对在非极性固定相中的溶中性离子对，而中性离子对在非极性固定相中的溶 解度大大增加，分配系数增大，分离效果明显得到解度大大增加，分配系数增大，分离效果明显得到 改善。这种方法被称为反相离子对色谱法。改善。这种方法被称为反相离子对色谱法。实现方法：用实现方法：用ODSODS柱，在流动相甲醇柱，在流动相甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水水 中加入中加入0.0030.01mol/L0.0030.01mol/L的的RPICRPIC试剂即可。试剂即可。离子对试剂离子对试剂 PICPIC价格较贵价格较贵分离碱类分离碱类- -烷基磺酸盐；分离酸

14、烷基磺酸盐；分离酸- -四丁基季铵盐。四丁基季铵盐。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法3.3.离子对色谱法离子对色谱法分离机理分离机理 以分离碱类为例以分离碱类为例 分配系数分配系数 其其K K除与除与RHPLCRHPLC有相同的影响规律外，有相同的影响规律外， 还与还与PICPIC试剂的碳链长度有关，链增长试剂的碳链长度有关，链增长K K增大。增大。13.3 各类高效液相色谱法 13.3.3 化学键合相色谱法4.4.离子抑制色谱法离子抑制色谱法弱酸、弱碱组分容易解离，在非极性固定相中的溶解弱酸、弱碱组分容易解离，在非极性固定相中的溶解 性很差，可通过调节流动相性很差

15、，可通过调节流动相pHpH来抑制它们的解离，使来抑制它们的解离，使 之以分子的形式存在，从而增加它在固定相中的溶解之以分子的形式存在，从而增加它在固定相中的溶解 度，增加保留作用，以达到分离目的。度，增加保留作用，以达到分离目的。适用范围适用范围 p pK Ka a：3737的弱酸，的弱酸，7878的弱碱的弱碱抑制剂抑制剂 乙酸、甲酸、氨水、磷酸盐、乙酸盐等。乙酸、甲酸、氨水、磷酸盐、乙酸盐等。容量因子及其影响因素容量因子及其影响因素 除与除与RHPLCRHPLC有相同影响因素有相同影响因素 外，主要受流动相外，主要受流动相pHpH的影响。的影响。对于弱酸对于弱酸，流动相的，流动相的pHpH p pK Ka a时，抑制解离，时，抑制解离，k增大、tR增大；流动相的；流动相的pHpHp pK Ka a时，利于解离，时，利于解离，k减小、tR减小。对于弱碱，情况相 反。13.3 13.3 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法 13.3.5 13.3.5 其他色谱法其他色谱法( (阅读阅读) ) 1.离子色谱法2.手性色谱法3.环糊精色谱法4.胶束色谱法5.亲和色谱13.4 固定相13.4.1 液-固色谱固定相 13.4.2 化学键合相 13.4.3 其他固定相13.4 固定相 13.4.1 液-固色谱固定相1.硅胶：无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶、堆 积