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1、实验二原核生物 基因组DNA的制备 一、实验目的v掌握从细菌中提取基因组DNA的基本原理v熟悉利用试剂盒提取细菌DNA的技术流程v提取卡介苗BCG基因组DNA二、实验原理v裂解细胞v除去蛋白质v析出DNAvCTAB(cetyltriethylammonium bromide，十六烷 基三乙基溴化铵)是一种去污剂，它能与核酸形成复 合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/l NaCl)中可 溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有CTAB- 核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。核酸提纯v(1) 用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多 糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液 中；接着可
2、用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出 来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。v(2) 降低溶液中盐的浓度(0.3mol/l NaCl)，CTAB与 核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大 部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将 CTAB-核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。三、实验材料v卡介苗BCGv细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）DP302v水浴锅、离心机、移液器v试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独 特的缓冲液系统提取细菌基因组DNA。v离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料， 可高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及 细胞中其他有机化合物。v回收的DNA可
3、适用于各种常规操作，包括酶切、 PCR、文库构建等实验。四、注意事项v实验中所有的废弃物均要高压灭菌。五、实验步骤（1）取细菌培养液1-5ml，10,000rpm，1min，尽量 吸净上清。 （2）沉淀中加入180l溶菌酶溶液（20mg/ml），37 ，60min。 （3）加入20l蛋白酶K溶液，混匀。 （4）加入220l缓冲液GB，振荡15s，70，10min， 溶液变澄清。瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。（5）加入220l无水乙醇，充分振荡15s，此时可能 会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水 珠。 （6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附 柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12
4、,000rpm ，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（7）向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD， 12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收 集管中。 （8）向吸附柱CB3中加入600l漂洗液PW， 12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收 集管中。（9）重复步骤。 （10）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm， 2min，弃废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，以 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（11）吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附 膜的中间部位悬空滴加50-200l洗脱缓冲液TE，室 温放置2-5min，12,000rpm，2min，将溶液收集 到离心管中。（为增加基因组DNA的得率，可将离 心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2min，12,000rpm，2min）五、结果检测v紫外吸收法检测所提取基因组DNA的浓度与纯度 ；v取少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离 并在核酸紫外检测仪上观察。少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电 泳分离图片六.思考题（1）操作第（4）步骤的时候溶液是否变得清亮？ 如果没有，试分析原因及可能对实验结果产生的影响 。 （2）试分析漂洗液PW的成分，在第10步骤中，如果 漂洗液没有充分晾干，会导致什么样后果？
