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1、基因克隆的基本原理及实验技术龙 跃 生2010年3月30日课时及内容安课时及内容安 排排n n第一课时第一课时: : 基因克隆的基本概念及理论知识基因克隆的基本概念及理论知识n n第二课时第二课时: : 基因克隆的操作过程及注意事项基因克隆的操作过程及注意事项n n第三课时第三课时: : 实验操作过程演示实验操作过程演示( (录像录像) )第一课第一课基因克隆的基本概念及理论知识基因克隆的基本概念及理论知识基因克隆的定义：基因克隆的定义：1. 1. 工具书上：工具书上：插入有同一个 插入有同一个基因或基因或DNADNA片段片段的重组质粒的一个群体，这个群体的重组质粒的一个群体，这个群体是由一个
2、重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或基因或 DNADNA片段片段的克隆。的克隆。2. 2. 学术文献上：学术文献上：(1)(1) 基因克隆是指在体外对基因克隆是指在体外对DNADNA按照即定目的和方案进行人工重组按照即定目的和方案进行人工重组, ,将将重重组组DNADNA进行扩增以获得进行扩增以获得目的基因目的基因的大量拷贝。的大量拷贝。(2)(2) 它是将它是将DNADNA或或基因组基因组的的DNADNA片段嵌入片段嵌入克隆载体克隆载体，再将载体植入培养，再将载体植入培养的的宿主细胞宿主细胞。 (3)(3) 科学家将这一过程称
3、为基因克隆：科学家将这一过程称为基因克隆：基因表达基因表达需有需有调节的调节的DNADNA片断片断控制控制，要使，要使克隆到的基因克隆到的基因能表达、发挥作用，必须将其与能表达、发挥作用，必须将其与调节单位调节单位连接起连接起来。来。什么是基因？什么是基因？1 1、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位遗传单位。 2 2、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNADNA片段片段。 3 3、编码一个编码一个RNARNA或一条多肽链的或一条多肽链的DNADNA片段称为一个基因。片段称为一个基因。4 4、基因是生物
4、体遗传的基本单位，存在于细胞的、基因是生物体遗传的基本单位，存在于细胞的染色体染色体上上，作直线排列。，作直线排列。5 5、基因通过指导、基因通过指导蛋白质蛋白质的合成来传递遗传信息，从而控制的合成来传递遗传信息，从而控制生物的生物的性状性状。染色体、染色体、DNA DNA 与基因之间的关系与基因之间的关系基因的结构及其表达蛋白的过程基因的结构及其表达蛋白的过程翻译蛋白质转录初级转录本（hnRNA）加工成熟mRNA加帽 加poly（A）基因（DNA）转录起始调控区 转录终止信号 转录起始点 外显子 内含子 转录终止点 5 非翻译区 3 非翻译区 RT-PCR双链cDNART-PCRRT-PCR
5、扩增基因的编码区序列扩增基因的编码区序列mRNA 5AAAAAAAAAAAAAAAAA 3 3 TTTTTTTTTTTT 5RT反应TTTTTTTTTTTT 5单链cDNA 3PCR扩增3 35 5转录起始调控区（启动子区）的扩增转录起始调控区（启动子区）的扩增基因（DNA）转录起始调控区 转录终止信号 转录起始点 外显子 内含子 转录终止点 PCR扩增3 35 5启动子区序列基因的编码区及启动子区序列必须通过基因的编码区及启动子区序列必须通过连接到连接到质粒质粒上构建成上构建成重组表达载体，重组表达载体，然然后进行目的片段扩增及功能研究。后进行目的片段扩增及功能研究。什么是质粒（什么是质粒（
6、PlasmidPlasmid）？）？质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒的重要特征质粒的重要特征（1） 是染色质外的环形双链DNA分子；（2）能自主复制，是能独立复制的复制子； （3）质粒对宿主生存并不是必需的；（4）质粒上常带有耐抗生素基因；（5）质粒DNA上有多个酶切位点。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（r
7、estriction endonuclease）:是从细菌中分离出来的一种识别并切割特异的双链DNA序列的内切核酸酶。目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序。GAATTC CTTGGAAAGCTT TTCGAAEcoR IG CTTGGAATTCAHind IIIA TTCGAAGCTTA限制性核酸内切酶的命名法则限制性核酸内切酶的命名法则限制性核酸内切酶的命名：一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如：EcoR I是从大肠杆菌Escherichia coli RY13 中第一个发现的内切酶I 。EEscherichia(属
8、)cocoli(种)RRY13(品系)I首先发现在此类细菌中发现的顺序DNA DNA连接酶是连接酶是19671967年在三个实验室同时发现的，最初是在大年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNADNA链上缺口酶，借助链上缺口酶，借助ATPATP或或NADNAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNADNA链的链的5-PO45-PO4与另一与另一DNADNA链的链的3-OH3-OH生成磷酸二酯键将生成磷酸二酯键将两条紧邻两条紧邻DNADNA链连接起来。链连接起来。 DNADNA连接酶连接酶GAATTC CTTGGA连接酶G CTT
9、GGAATTCA连接酶CTG GACATTTAACTGATT GACTAA内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种重要的重要的工具酶工具酶，它们如同分子生物学家，它们如同分子生物学家剪刀剪刀和和针线针线，可以任意地将感兴趣的基因片段进，可以任意地将感兴趣的基因片段进行切割和连接，实现行切割和连接，实现DNADNA序列的重组。序列的重组。质粒质粒(plasmid)(plasmid)和载体和载体(vector)(vector)有什么区别？有什么区别？质粒是指细菌细胞质中的小型环状DNA分子，是天然存在的，主要控制细菌的次级代谢。载体是指在基因工程中用以协载目的基因的小型
10、环状DNA分子，载体一般是经过改造的质粒，还包括病毒，部分高等生物细胞中的DNA。载体的种类载体的种类克隆载体：一般是只用来在大肠杆菌中扩增基因序列的拷贝数。表达载体：除了能扩增基因序列的拷贝数之外，还能在原核或真核细胞中表达目的蛋白，也可用鉴定基因表达调控元件的功能。根据表达目的蛋白所使用启动子不同分为原核表达载体（原核启动子）和真核表达载体（真核启动子）。TATA克隆载体克隆载体TTAA酶切位点定向克隆的克隆载体酶切位点定向克隆的克隆载体EcoR I+Hind III切EcoR I Hind IIIEcoR I Hind IIIEcoR I Hind IIIEcoR I Hind III
11、AAEcoR I+Hind III切PCR扩增EcoR IHind III表达载体表达载体根据表达目的蛋白所使用启动子不同分为：原核表达载体（原核启动子）真核表达载体（真核启动子）原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体目的蛋白表达载体中的表达盒目的蛋白表达载体中的表达盒启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）基因克隆基因克隆是将是将DNADNA或或基因组基因组的的DNADNA片段嵌入片段嵌入克隆载体克隆载体，再将载体植入培养的，再将载体植入培养的宿主细胞，宿主细胞，进行载体扩增或表达蛋白。进行载体扩增或表达蛋白。大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（Esc
12、herichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。大肠杆菌在生物技术中的应用 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。生物安全性生物安全性生物工程用的菌
13、株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致。此外，生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。基因克隆的实验常用菌株基因克隆的实验常用菌株1 1：DH5a DH5a 常用于质粒克隆的菌株。使用常用于质粒克隆的菌株。使用pUCpUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的系列质粒载体转化时，可与载体编码的 半乳糖苷酶氨基端实现半乳糖苷酶氨基端实现 互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。互补。可用
14、于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 2 2：TOP10TOP10该菌株适用于高效的该菌株适用于高效的DNADNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 3 3：HB101HB101该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 4 4：JM109JM109该菌株在使用该菌株在使用pUCpUC系列质粒载体进行系列质粒载体进行DNADNA转化或用转化或用M13 phageM13 phage载体进行转染时载体进行转染时 ，由于载体，由于载体DNADNA产生的产生的LacZaLacZa多肽和多肽和J
15、M09JM09编码的编码的LacZM15LacZM15进行进行 互补，从互补，从 而显示而显示 半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 5 5：BL21(DE3)BL21(DE3)用于高效表达克隆于含有噬菌体用于高效表达克隆于含有噬菌体T7T7启动子的表达载体（如启动子的表达载体（如pETpET系列）的基因。系列）的基因。 T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶位于聚合酶位于 噬菌体噬菌体DE3DE3区，该区整合于区，该区整合于BL21BL21的染色体上。该的染色体上。该 菌适合表达非毒性蛋白。菌适合表达非毒性蛋白。质粒转化大肠杆菌的过程质粒转化大肠杆菌的过程 基因克隆实验的一般过程基因克隆实验的一般过程获得基因
