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1、上海德诺产品检测有限公司上海市乳品质量监督检验站农业部食品质量监督检验测试中心(上海)中国上海江场西路1550号3号楼 网址：氨基甲酸酯类农药的柱后衍生简介及关键点主讲：何亚斌2012.07衍生化的定义 衍生化是一种利用化学变换把化合物转 化成类似化学结构的物质。 一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生反 应，溶解度，沸点，熔点，聚集态或化学成分 会产生偏离。由此产生的新的化学性质可用于 量化或分离。 衍生化的目的衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测 性。把难于分析的物质转化为与其化学结构相似 但易于分析的物质，便于量化和分离。 对于GC来讲，多数是为了增强目的物挥发性或 者改善目的物极
2、性; 对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物 的响应。 衍生化常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷 化、硼烷化、环化和离子化等衍生化试剂简单的说:它能帮你将不能分析的样品通过 衍生化试剂反应转化为可分析的化合物.种类:烷基化试剂、硅烷化试剂、酰化试剂 类、荧光衍生化试剂、 紫外衍生化试剂、 苯甲酰氯为衍生化试剂、羟基衍生化试剂 、 手性衍生化试剂、氨基衍生化试剂。判断衍生化反应的指标 1、反应是否迅速、定量进行，反应重复性好坏 ，反应条件是否温和，是否容易操作。2、反应选择性高，最好只于目标化合物反应。3、衍生化产物只有一种，反应的副产物和过量 的衍生化试剂应不干扰目标化合物的分离和检测
3、 。4、衍生化试剂通用性好，价廉易得。衍生化方法应用不当的弊端1、柱上衍生化可能损伤色谱柱。 2、某些衍生化试剂需氮气吹干。 3、衍生化不完全，影响灵敏度。4、衍生化试剂不当，产物分子量过大。衍生化分类1. 从是否形成共价键来说，可分为：标记 和非标记反应。 标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试 剂之间生成共价键； 所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、 氧化还原、电化学反应等都是非标记反应。2.从衍生反应的场所来说，可分为： 柱前衍生化(pre-columnderivatization)；柱上 衍生化(on-columnderivatization)；柱后衍生 化(post-colum
4、nderivatization)三种。 3.从是否与仪器联机的角度来分有： 在线(on-line)、离线(off-1ine)和旁线(at-line)( 自动化)三种。 目前在HPLC中以离线的柱前衍生法(简称 柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱 后衍生法)使用居多，旁线衍生化方法是发 展方向。柱前衍生和柱后衍生定义柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍 生剂反应，反应产物在分析柱上实现分离 ，实际分离的是衍生产物，检测的也是衍 生产物;柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后 ，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分 离的是目的物，在检测器处检测的衍生产 物。柱前衍生法的优缺点优点： 相对自由地选择
5、反应条件； 不存在反应动力学的限制； 衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰； 容易允许多步反应的进行； 有较多的衍生化试剂可选择； 不需要复杂的仪器设备。 缺点： 形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难； 在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品 损失。柱后衍生的优缺点优点： 形成副产物不重要，反应不需要完全，产物也不需要 高的稳定性，只需要有好的重复性即可； 被分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用 已有的分析方法。 缺点： 对于一定的溶剂和有限的反应时间来说，目前只有有 限的反应可供选择； 需要额外的设备，反应器可造成峰展宽，降低分辨率 。柱后衍生技术的应用 氨基酸；
6、链霉素以及其他氨基糖苷类抗生素，包括：庆大 霉素、阿泊拉霉素、新霉素等。 氨基甲酸酯： 涕灭威亚砜、涕灭威砜、草氨酰、灭多虫、3-羟基呋 喃丹、涕灭威、残杀威、呋喃丹、 西维因（胺甲萘） 、1-萘酚、灭虫威、BDMC内标 草甘磷以及百草枯、敌草快等除草剂 黄曲霉毒素等毒素。 其它应用： 聚醚抗生素、串珠镰孢毒素、贝毒 等毒素、单端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉 毒素、 生物胺、甲醛、类固醇等。如何实现柱后衍生衍生试剂原理氨基甲酸酯类农药的柱后衍生原理 氨基甲酸酯类农药的结构中均含有下N-甲 基氨基甲酰基。氨基甲酸酯类农药的柱后衍生氨基甲酸酯类农药按照在C18、 C8柱上的 洗脱顺序流出。分离后的氨基甲
7、酸酯农药首先在100下 在NaOH作用下水解释放出醇，碳酸盐和 甲胺。在第二个柱后反应中甲胺与邻苯二 甲醛（OPA和2-巯基乙醇反应生成有强荧 光吸收的1-甲基-2-蚓哚类化合物，被荧光 检测器检测且具有很低的检测限，满足残 留分析方法的要求。 氨基甲酸酯类农药的柱后衍生原理氨基甲酸酯类农药的柱后衍生 柱后衍生系统图氨基甲酸酯类农药的柱后衍生氨基甲酸酯分析的柱后条件： 衍生试剂1：水解衍生试剂CB 130 衍生试剂2：100mg OPA, 2g Thiofluor溶解于950mL CB 910 反应器1：100，0.5mL 反应器2：环境温度 衍生试剂流速：0.3mL/min 检测条件： 荧光
8、检测器：ex 330nm , em 465nm 氨基甲酸酯分离柱（4.6250mm）, C18, 5um 反应试剂的准备OPA衍生试剂水解试剂反应试剂的准备 1.水解试剂 用甲醇彻底清洗两个反应试剂瓶，并用甲醇 清洗浸在反应试剂中的管线。 水解试剂不需要制备，直接将水解试剂(CB 930)倒入到标有水解试剂标签的反应试剂瓶中 。 注！水解试剂不建议自己制备，因为很难 得到足够纯度的NaOH 。 反应试剂的准备2. OPA试剂 a. 倒入945mL OPA稀释剂（CB 910）到反应试剂瓶 中（留下5mL备用）。 b. 盖上瓶盖，打开Vent阀，打开气源，用惰性气体鼓 泡至少10分钟。 c. 溶
9、解100mg OPA到大约10mL HPLC级甲醇中。 d. 关闭气源，移走瓶盖，加入OPA溶液到已经脱氧的 OPA稀释剂瓶中。 e. 溶解2g Thiofluor (Cat. No. 3700-2000)到刚才剩下 的5mL OPA稀释剂中，然后加入到反应试剂中。 f. 盖上瓶盖并打开气源，连续鼓泡1min。轻摇试剂瓶 直到完全混合。 注意!如果没有Thiofluor(N,N-二甲基-2-巯基乙胺盐酸 盐)，移取1mL 2-巯基乙醇。处理2-巯基乙醇应 该在通风橱内进行，因其易挥发和不愉快的臭味 。 不推荐自己制备OPA稀释剂，因为硼酸钠（任何 级别）含有过量的重金属和不溶物，这些杂质最 终会沉淀在反应器和流通池内。 水解试剂比较稳定，而OPA试剂易于氧化且一直 降解。在惰性气体体密封下，OPA试剂可以维持 两周而没有明显的活性降低。 清洗系统衍生试剂换成水冲洗管路30min； 反应池温度设为小于60； 将水换成水/甲醇（80/20）溶液，再冲洗 30min。不同仪器不同功能，可根据仪器的操作手 册操作。氨基甲酸酯类农药的柱后衍生注意点合适的C18柱，使各个农药有效的分离； 水解试剂和衍生试剂不可以弄错，如果反 发了则无法衍生； 反应试剂给予的流速一定要稳定；反应池 的温度控制也一定要稳定； 做好回收率试验。问题？谢 谢Thank you
