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1、第六章 细胞融合 (Cell fusion)6.1 概述 细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic hybrydization）或细胞杂交（cell hybrydization ）：在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型的单细胞通过无形方式融合成一个杂合细胞,生产特殊生物制品、分化再生新物种或新品种的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。目前被广泛地应用于单克隆抗体、生物的远缘杂交、新品种的培育和人类基因图工作（小鼠和人类细胞融合）。6.1 概述 受精：雌雄生殖细胞间的自然融合。体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎动物肿瘤细胞的多核现象。其
2、后发现骨髓、肺组织 和各种正常组织及炎症和坏死部位的多核现象。实验体细胞融合：在细胞培养技术之后。首先 （Lambert）发现体外培养的肿瘤细胞自发融合。 后（Okata,1962）发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合，开创了动物细胞融合的崭新领域。其后 不同动物细胞、植物和微生物原生质体融合技术也 相继发展起来。6.1.1 细胞融合的意义 细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新物种或新品种的技术。意义：可应用于优先选择改良、克服远缘杂交中的不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传性状，从而培养出理想的品种。可以避开生殖
3、细胞的受精过程，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种或杂合细胞。还可创造细胞质杂种。6.1.2 细胞融合的原理和融合材料1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞融合细 胞新生物（或杂合细胞）。两种不同植物的体细胞经纤维素酶、果胶酶消化，除去细胞 壁，得到原生质体（或动物细胞），通过化学或物理方法诱导 其细胞融合形成杂种细胞；以适当的技术进行杂种细胞的分拣 和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直到分化 发育成杂种植株，实现基因在远缘物种间的转移。2、融合材料（1） 植物或微生物原生质体的制备（2） 动物单个细胞的获得获得步骤：（1） 组织的获得、（
4、2） 组织的消化、（3）原生质体或动 物单细胞的分离。6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.1 原生质体的制备1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。2. 制备原生质体：机械法；酶解法酶解法：（1） 取材消毒（2） 酶解制备（3） 原生质体收集3. 原生质体的纯化方法过滤-离心法；漂浮法；沉降法和漂浮法结合6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.2 原生质体培养方法：（1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中培养。（2） 固体平板法：固体培养基上培养。类似植物单细胞培养法（3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液培养原生质体6.1.4 动物单个
5、细胞的获得 动物单细胞的获得：1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离心，留下组织块。2、组织的消化：胰蛋白酶消化：向组织块中加入3050倍体积的胰蛋白酶液。37水浴内消化，每510分钟摇一次。Hanks漂洗两次。800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择 细胞融合技术主要有：生物法仙台病毒法化学法PEG结合高Ga2+、pH诱导法物理法电融合诱导法融合细胞的选择：融合细胞的类型：同核体；异核体；多核体。常用的选择方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选法；生长特性筛选法；物理特性筛选法；其他方法6.
6、2.1 生物法仙台病毒法 灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）： 1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间相互渗透，胞质互相渗透。3.两个原生质体的细胞核相互融合，融为一体。4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。6.2.2 化学法PEG结合高Ga2+、pH诱导PEG法诱导原生质体的机制尚不十分清楚，初步分析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的黏着而结合。用高钙离子和pH溶液将与质膜结合的PEG分子
7、进行洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。6.2.2 化学法PEG结合高Ga2+、pH诱导1. 做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型抗性等。2. 两种原生质体（密度105个ml）按1:1等量混合。3.PEG的分子量为40006000，加热融化与Eagle溶液配 成50%。加入PEG后，24培育1020min，缓缓加入高 pH、高钙离子液,15分钟后冲洗液冲洗，离心收集原生质体。4.计算融合率融合率=（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的 细胞核总数）100%6.2.3 物理法电融合诱导法 是20世纪80年代出现的细胞融合技术
8、。在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点：融合率高、重复性好、对原生质体伤害小、装置精巧、方法简便、可在显微镜下观察或录象融合过程、诱导过程可控性强等。A 平行多电极融合装置示意图B 电融合微室示意图 上：俯视图 :下侧面图在交流电场中原 生质体排列成念 珠状、发生融合电融合设备及原理图6.2.3 物理法电融合诱导法 电融合诱导法：1. 亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3，整个装置放在一个培养皿中。2. 微电极型的两个电极的
9、端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，512mA脉冲电流刺激15mS,原生质体在累计几秒到几十秒时间内暂时收缩，两膜间形成小孔，连接成桥，经点到面完成连接，最后形成融合体。3. 经平行电极的1兆赫交流双向脉冲，原生质体极化产生偶极子，紧密排列成串珠状。在适当时间和强度的直流电（如50mA，1.22kV）脉冲作用下，击穿质膜，成融合体。6.2.4 细胞融合的影响因素植物细胞融合效率与外界条件有关：（1）PEG诱导融合：关键是作用时间。尤其是高钙离子和pH溶液处理时间。（2）PEG规格和纯度与融合效率有关。（3）电场诱导融合：融合率与原生质体密度有关。（最适 21048104）（4）融合液中加少
10、量氯化钙，可维持一定电导率，对细胞有保护作用；电流强弱、处理时间、电脉冲大小会影响融合率。（5）在促融剂中添加刀豆蛋白、胰蛋白酶、精胺、亚精胺等可提高融合效率。动物细胞融合过程中，促融剂、细胞性质、温度、pH、离子强度、离子种类等影响融合效率。 （1）亲本细胞表面性质影响较大。表面覆盖绒毛，不规则者易融合，光滑者不易融合。 （2）细胞种类不同，融合效果不同。如腹水癌及株化细胞易融合，淋巴和血细胞几乎不融合。 （3）细胞融合时需要适宜温度和运动（震摇）状态。 （4）细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。有些细胞在无氧下也可融合。 （5）有些细胞融合时需要钙离子，否则不融合，细胞蛋白质
11、也发生变化。 （6）最适pH为7.47.8之间。此范围外，融合率较低。6.2.5 动物细胞融合6.2.6 融合细胞的筛选 1、融合细胞的类型： （1）同核体同缘原生质体的融合体。 （2）异核体非同缘原生质体的融合体。 （3）多核体含双亲不同比例核物质的融合体。2、筛选融合细胞的常用方法： （1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一个亲本的缺陷，从而令杂 种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。 （2）抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素和除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择细胞。抗性 突变体或抗性有差异者可用此法。2、筛选融合细胞的常用方法：（3）生长特性筛选法：利
12、用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。如外源激素。（4）物理特性筛选法：亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种细胞。（5）其他方法：显微操作技术也能把单个异核体分离出来。双亲融合，则具有与双亲不同的荧光标记。采用无毒荧光素标记双亲原生质体，融合后利用电子荧光激活选择器自动分类和选择融合细胞。6.2.6 融合细胞的筛选6.3 细胞融合技术的应用举例 现代植物细胞融合技术研究是从20世纪六十年代才开始的。1972年美国科学家卡尔逊开发出杂种烟草；1978年德国科学家梅歇尔斯首次将番茄与马铃薯细胞融合成功，预示着地上结西红柿、地下结土豆的新植物的可能。 1978年瑞
13、士科学家埃勒门和美国的柯路斯将人体的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合后培育成含人体染色体的人造小鼠。近年，科学家利用以细胞融合为核心技术的操作取得了很大科研成果。6.3.1 动物细胞融合单克隆抗体 英国科学家科莱尔和米尔斯坦（1975）合作将适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细 胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，发现融合的杂交 瘤细胞具有双亲细胞特征，通过克隆化可使杂交 细胞成为单纯的细胞系。由此单克隆系可以获得 结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克 隆抗体。动物细胞融合最具价值的成就是利用杂交瘤技术生产单克隆抗体。6.3.1 .1 杂交瘤技术的基本原理Burnet(1957)提出克隆选
14、择理论：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子，那么，从一个单克隆 细胞产生的抗体分子就是单克隆的，且该单克隆抗体 具有独特的均一结构。此假定经各种实验得以证实。将瘤细胞与B细胞融合，培养成既能产生单一抗体，又能在体外快速生长的杂交瘤细胞。该杂交瘤细 胞群经单克隆化，持续分泌成分单一的特异性抗体， 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,MCAB）。骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的混合物中有三种细胞：没融合的两种细胞与杂交瘤细胞。1、亲本细胞的选择（1）骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞本身不分泌抗体（保障杂交瘤细胞产生单抗）；有无限分裂的能力；黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT）
15、或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK）在HAT培养基中不能生存增殖。（2）B淋巴细胞：经特定抗原免疫能产生目的抗体的淋巴细胞，且被免疫动物种系与骨髓瘤细胞一致或相近亲缘关系。6.3.1 .1 杂交瘤技术的基本原理2、培养基的选择（HAT培养基）：为去除未融合的骨髓瘤细胞，在培养液中加次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶脱氧核苷（T）。A 阻断正常细胞DNA合成主路途径（二氢叶酸到四氢叶 酸），故只有能利用H和T的正常细胞从旁路合成DNA 才不死亡（脾脏细胞有最高分裂次数或不分裂， 死亡）骨髓瘤细胞：（ HGPRT和TK）无法利用旁路合成 DNA，主路又被A阻断，故单纯的瘤细胞不久即死亡。杂交瘤
16、细胞：具有瘤细胞（无限分裂的能力）特性和 野生型淋巴细胞 （ HGPRT+和TK+）旁路合成DAN的特性，长期生存，从而被分离出来。6.3.1 .1 杂交瘤技术的基本原理6.3.2 杂交瘤技术的过程1、融合细胞的制备： （1）脾淋巴细胞：1）经免疫的小鼠放血致死，无菌操作取脾脏， 去胞膜；2）用RPMI-1640或DMEM培养液清洗，放在盛 10毫升培养平皿的双层铜丝网上；3）用注射器内玻璃管芯将脾淋巴细胞轻轻挤压 到培养液中；4）计数后将细胞液装入加盖离心管内，置于冰 箱备用。1、融合细胞的制备（2）骨髓瘤细胞：1）选择形态好的骨髓瘤细胞，加0.2%台盼蓝染液，计数（活细胞80%以上）；2）1500r/min离心，弃上清液，加20ml培养液清洗后再次离心。（可用于杂交融合） 6.3.2 杂交瘤技术过程6.3 .2 杂交瘤技术
