全内反射荧光显微镜

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1、全内反射荧光显微镜医学实验05级张园 郑雪飞 宋一萌 解依荻发展历史优势应用分型及结构基本原理发展与展望发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。 发

2、展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显 微中的几个重要问题：1.显微图像的信噪比不高；2.光源对生物样本照射的损伤；3.光学衍射所致的分辨极限（R 0. 61/nsin）：传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响, 存在分辨极限,瑞利将之归纳为R 0. 61/nsin(u/2) ,其中R为分辨力 ,为成像光波波长, nsin(u/2)为物透镜的数值孔径,即NA 值，u为孔 径角,因此光学显微镜空间分辨极限250 nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了

3、一系列光学显微镜。 其中，其中，全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术(Total internal (Total internal reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,TIRFMTIRFM) )是是 近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程Hirsch field 完成了 第一个 全内反射 荧光实验1965年 Axelrod等生物物理 学家对TRIFM技术 及基本原理进行描 述，并探索了其生 物应用。 20 世

4、纪8080年代早期年代早期 20 世 纪90年代新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的 出现，使TRIFM技术 得到充分发展。1995年Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像。该项技术已经应用到 许多单分子的研究中这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光 法测液体中的单个分子的荧光法测液体中的单个分子的荧光 。将全反射理论与生物细胞的。将全反射理论与生物细胞的 荧光成像技术相结合是一种全荧光成像技术相结合是一种全 新的突破。新的突破。 肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生， 荧光标记驱动

5、蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。1996年Moerner小组 又用这项技术 实现了限制在 丙烯酰胺胶体 的纳米孔中的 单分子的三维 成像。至今基本原理全内反射荧光显微镜 的基本设计思路全内反射荧光显微镜 的基本原理全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波 激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受 到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面， 单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其 它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm 甚至更低的空间分辨率。基本原理全内反射荧光显微镜 的基本设计思路全内反射荧光显微镜 的基本原理荧光激发原理荧光捕捉原

6、理snell定律:n1sin 1=n2 sin 2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:2=90 c=sin-1(n2/n1) 即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光激发原理沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数衰减。 隐失波的强度-深度图荧光激发原理非均匀波 透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式 T12（i）- 分界面处的透射强度d 12 - 渗透深度i - 入射角 - 入射光波长对于可见光波长 380 780nm而言 ，浸透深度为 100nm。荧光激发原理箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。

7、黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点表示未被激发的荧光分子。荧光捕捉原理CCD相机 CCD相机的高灵敏度高灵敏度特点使 全内反射荧光显微镜利用消逝波照 射样品并使其成像成为可能，也成 就了其高信噪比。 CCD相机的快速成像快速成像特点提 高了其时间分辨率，使得观察单分 子的运动、细胞物质的分泌、蛋白 质的相互作用成为可能并成为这方 面的优势观察仪器。 目前使用CCD 探测 ,可达到的量子产率 已到80 % ,成像 速率200 Hz.当对活细胞 成像时,为了 达到单分子 级的灵敏度 或是为了减 少曝光时间, 需要采用图 像增强器。荧光捕捉原理全内反射显微镜的分型及其结构 全内反射荧

8、光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。 （一）棱镜型全内反射荧光显微镜 利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图评价棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。（二）物镜型全内反射显微镜收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜 发生全内反射的光学器件。 由于细胞的典型折射率为1. 331. 38 , 因此要想实现全

9、内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为： NA = nsin（u/2） nsin（u/2） nsinc NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的 折射率(浸没油) 和孔径角。c 为发生全 反射的临界角。二者比较棱镜型全内反 射荧光显微镜 物镜型全内反射荧光显微镜05级医学实验 宋一萌 90513111全内反射荧光显微技术利用全内反射产生 的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。 当今世界上研究单分子科学最具前途的新 型生物光学显微技术之一 可用来实现对单个荧光分子的直接探测。全内反

10、射荧光显微镜里用消 逝波作为样品的激发光源， 并用有着高灵敏度和高时间 分辨率的CCD相机(成像速率 200Hz)捕捉样品荧光，因此 具有如下优点：1：信噪比高（相对共聚焦显微镜） 2：分辨率高（相对其他的光学显微镜 ） 3：对生物样本损伤小（相对电镜）可 以进行活体物质的研究和单分子的动 态研究。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优 势(它的荧光激发深度只在100 nm 的薄 层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生 物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成 像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像 的要求;另一方面它的图像解释相对于近场,

11、干涉显微成像来说也较简单。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动全内反射荧光显微术的发展一方面会 在加强传统优势的基础上，即动态观 察生物大分子的结构、相互作用、物 质的分泌，同时在不断的改进物镜和 CCD相机的性能基础上进一步同其他 仪器的结合，更多的用在生物细胞活 体方面的研究。 1.全内反射荧光显微术 在生物单分子科学中的应用 单分子荧光探测主要有三个问题： （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱 的，所以要寻找一个足够灵敏的探

12、测器。 （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光 等产生的背景光，极大的干扰了信号光的 探测。所以应该尽量降低背景激发光。 （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景 光。这些问题都可以利用全内反射荧光显微成 像系统来解决全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的 过程进行观测，而不受到来自细胞内深层 区域信号的干扰。全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学 如生物化学动力学、单分子动力学的最有 前途的光学成像技术利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态 构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光 显微术。 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白， 然后用分光镜检测。肌

13、球蛋白分子上荧光 基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象 ，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变 。2.蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反 射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接 观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到 。 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co- chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相 互作用已经在单分子水平进行了很好的研 究。 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平 生物大分子相互作用的成像。3.离子通道研究 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜 调节离子电流和电化学势。 单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方 法来检测各种通道的电特性。

14、 目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信 号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到 平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微 镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展 的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到 离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用， 同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。 4.吸附用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分 子吸附行为 。全内反射荧光显微镜下拍到 的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分 子图分别在全内反射荧光显微镜下（左）和 一般荧光显微镜（右）拍到的Dil- stainedneuron,细胞。全内反射荧光显微镜（TIRFM

15、）是研究紧贴固体 平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固 体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数 性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对 结果的解释具有一定的困难性。 因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技 术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。 The application of the total internal reflection fluorescence microscopy解依荻全内反射应用的核心问题l l全内反射应用的核心问题是全内反射应用的核心问题是 制作与电子显微术（制作与电子显微术（EMEM）切）切 片尺寸相当的光学切片。片尺寸相当的光学切片。共焦技

16、术 VS.全内反射技术l共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析 深度分别为500800nm。l全内反射显微术: 典型的垂直照明深度 100nm。l结论：薄的光学层析层切片信噪比强；细胞的光损伤和光漂白影响也很小。全内反射的应用l在生物单分子研究中的应用l直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域 信号的干扰.l全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在200 的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物 化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像 技术。全内反射的应用比较l与其他生物单分子研究技术的比 较全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM）全内反射的应用比较l l全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（TIRFMTIRFM）l全内角反射荧光显微镜（total internal