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1、第二章 细菌学检验基本技术邵丽军1主要内容第一节 样本的采集与送检原则第二节 细菌的分离培养方法第三节 细菌的形态结构检查法第四节 细菌的生化反应检查法第五节 细菌的血清学检验第六节 细菌毒素的检测第七节 细菌数量的测定第八节 细菌L型检验第九节 微生物菌种的保藏及保管2第一节 样本的采集与送检原则 一、细菌学检验样本的类型正常人体样本，如排泄物、血液、血清等食品、水产品、化妆品、药品、消毒及卫生用品、医疗用品及环境（水、土壤、空气，各种物品）等卫生样本，包括常规卫生评价、公共卫生事件、环境监测、委托送检等标本临床各种感染材料（试剂、样品、耗材、医疗废弃物等）动物尸检或感染材料。3二、采样的一
2、般原则（1）无菌原则采样用具要无菌且在有效期内；采样操作程序要无菌；如果采样部位需要经过皮肤和粘膜时，做好外表面的消毒，防止污染。密封送检（2）选择正确的采样时间分离病原菌时，应早期采样；最好是病人发病早期、急性期或症状典型时；用药前采样，或停药24h采样，或下一次用药前采样用于血清学诊断时，急性期及恢复期采集双份血清。4（3）选择正确的采样部位根据感染特点、病程发展及目的菌可能存在的部位，选择合适的解剖部位采样。（4）采集足够量样本采样量不能太少，过少样品会导致假阴性结果；卫生样本要具有代表性，否则会影响评价的准确性。（5）多样性采集感染进程复杂的，应多部位或多时间段采样，以防漏检。（6）做
3、好采样记录记录样本类别、采样时间、地点、采样量及采样人等信息。5三、样本送运原则（1）选择适当的温度和时间送检时间长或温度高，菌相将发生改变，影响结果的准确性；应遵循尽快送检的原则；常规细菌学检查，不超过2h，最好1h内，保存在4中不超过24h。含有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等的样品，低温自溶，应在25常温送检或用便携式培养箱送检6（2）选择正确的气体环境针对厌氧菌样本，注意隔绝空气氧；如使用专门的厌氧采样瓶或试管，或人为的排出空气，或直接接种于厌氧培养基或放在厌氧袋、厌氧盒中（3）保持密闭状态7便携式恒温培养箱便携式冷藏保温箱厌氧培养袋厌氧罐 厌氧瓶8第二节 细菌的分离培养方法细
4、菌的分离培养提供细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），从样本中获得该种细菌活的纯化物的过程。n主要内容包括培养基制备、细菌接种方法、细菌培养方法、细菌的生长现象 910一、培养基的制备培养基是指经人工配制，将供细菌生长繁殖需要的各种营养物质按比例配制而成的基质，可用于细菌的分离纯化、传代、鉴定、菌种保存等。11（一）培养基的主要成分及其作用P261. 营养物质：碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。2. 水分：常用蒸馏水。3. 凝固物质：琼脂、明胶4. 抑制剂和指示剂：如胆盐、抗生素、酸碱指示剂、氧化还
5、原指示剂等。12（二）培养基制备的一般程序调配矫正pH过滤澄清分装灭菌检定保存称量、溶解氢氧化钠、盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 高出所需pH0.1-0.2个单位先调pH，沸水加热5-10min，冷却 后过滤；滤纸、绒布等过滤液体：不超过容器2/3；斜面： 1/管；半固体培养基 ：1/3管 ；高层斜面：1/41/3管 ；平板：1315ml耐高压：121，15min 含糖：115 ，15min 鸡蛋、牛奶等：间歇灭菌3天3次 不耐高温的血清、尿素等：滤过除菌外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去 。 无菌试验：放入
6、无菌试验：放入361361过夜，有菌生长弃去。过夜，有菌生长弃去。 功能检查：标准菌株培养功能检查：标准菌株培养242448h48h，无菌或生长不好。重复接种结，无菌或生长不好。重复接种结 果仍同前，弃去。 果仍同前，弃去。 冷藏，不宜过久。 防止干涸、变质和污染 。13所用器材及过程所用器材及过程培养基、玻璃器皿 天平、药匙 141. 以量筒装取适当量蒸 馏水于玻璃容器中 2. 于玻璃容器上标示培 养基名称 151. 放上秤药纸 並归零 2. 以秤药匙舀 出适当量药 品 (请看培 养基配方上 说明) 16倾倒培养基时小心 不要沾到玻璃壁上 171. 清理配药桌面与天平 2. 清洗秤药匙，擦干
7、放回 3. 药品放回药品柜 181. 按物理性状分类液体培养基半固体培养基（琼脂含量0.51%）固体培养基（琼脂含量22.5%）（三）培养基的种类19液体培养基液体培养基 主要用于增菌培养、生化试验等主要用于增菌培养、生化试验等沉淀生长混浊生长表面生长液体培养基中生长20制备平板、斜面、高层及高层斜面，用于制备平板、斜面、高层及高层斜面，用于 细菌分离培养、鉴定和保存、増菌等。细菌分离培养、鉴定和保存、増菌等。固体培养基固体培养基 21观察微生物的动力，分类鉴定、保存菌观察微生物的动力，分类鉴定、保存菌 种以及噬菌体效价滴定等。种以及噬菌体效价滴定等。 有鞭 毛， 混浊 生长无鞭 毛， 沿穿
8、刺线 生长半固体培养基半固体培养基 222. 按成分分类合成培养基由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是 无机盐类，或无机盐类加有机物质。各批次性质稳定，用于细菌代谢、分类、菌种选育 、遗传分析等情况使用。天然培养基化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致， 如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。成本较低，在细菌学研究中常用。233. 按用途分类（1）基础培养基含有大部分细菌生长繁殖所需的最基本的营养成分。普通肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等（2）营养培养基在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等营养成分，以 满足对营养要求较高和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖 。血液琼脂培养基、血清肉汤培养基、巧克力
9、血琼脂培养基 。（3）增菌培养基在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质 ，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。多为液体培养基，一般具有选择性抑制作用的抑制剂。有助于目的菌的增殖24常用増菌培养基常用増菌培养基 胆盐乳糖培养基（BL）大肠杆菌增菌 亚硒酸盐增菌培养基沙门氏菌增菌亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基食品中沙门氏菌增菌四硫磺酸钠亮绿基础培养基沙门氏菌增菌GN肉汤培养基志贺氏菌增菌碱性蛋白胨水培养基霍乱弧菌增菌7.5%氯化钠肉汤培养基金黄色葡萄球菌增菌缓冲蛋白胨水培养基沙门
10、氏菌增菌血液增菌培养基血液中细菌增菌SCDLP液体基础培养基化妆品中细菌增菌25（4）选择性培养基多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它 非目的菌的生长或使其生长不佳。26常用的选择培养基常用的选择培养基 名名 称称 用用 途途SSSS琼琼琼琼脂培养基脂培养基 沙沙门门门门氏和志氏和志贺贺贺贺氏菌属分离氏菌属分离HEHE琼琼琼琼脂培养基脂培养基志志贺贺贺贺氏菌分离氏菌分离鉴别鉴别鉴别鉴别伊伊红红红红美美蓝琼蓝琼蓝琼蓝琼 脂培养基脂培养基 大大肠肠肠肠杆菌、杆菌、产产产产气杆菌分离气杆菌分离鉴别鉴别鉴别鉴别麦康麦康凯琼凯琼凯琼凯琼 脂培养基（脂培养基（MacCMacC）肠肠肠肠道致病菌分离道致病
11、菌分离甘露醇高甘露醇高盐琼盐琼盐琼盐琼 脂培养基）脂培养基）绿脓绿脓绿脓绿脓 杆菌分离杆菌分离鉴别鉴别鉴别鉴别XLDXLD琼琼琼琼脂培养基脂培养基志志贺贺贺贺氏、沙氏、沙门门门门氏菌分离氏菌分离中国中国蓝琼蓝琼蓝琼蓝琼 脂培养基脂培养基肠肠肠肠道菌分离道菌分离鉴别鉴别鉴别鉴别碱性碱性琼琼琼琼脂培养基脂培养基霍乱弧菌分离霍乱弧菌分离高高盐盐盐盐蔡氏蔡氏琼琼琼琼脂培养基脂培养基真菌、酵母菌分离真菌、酵母菌分离27（5）鉴别培养基利用各种细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产 物的不同，在此类培养基中加入了某些特定的作用底 物，用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细 菌。名名 称称用用 途途 蛋
12、白蛋白胨胨胨胨水培养基水培养基靛基靛基质质质质和霍乱和霍乱红试验红试验红试验红试验 乳糖胆乳糖胆盐发盐发盐发盐发 酵培养基酵培养基大大肠肠肠肠杆菌杆菌发发发发酵乳糖酵乳糖试验试验试验试验 0.5%0.5%乳糖乳糖发发发发酵培养基酵培养基肠肠肠肠道菌生化道菌生化试验试验试验试验 （复（复发发发发酵酵 ） 半固体培养基半固体培养基动动动动力力试验试验试验试验 和菌种保存和菌种保存 三糖三糖铁琼铁琼铁琼铁琼 脂培养基（脂培养基（TSTTST）肠肠肠肠杆菌糖杆菌糖发发发发酵及硫化酵及硫化氢氢氢氢反反 应应应应 氰氰氰氰化化钾钾钾钾基基础础础础培养基培养基沙沙门门门门氏菌分离氏菌分离 脱脱羧羧羧羧酶酶试验对试验对试验对试验对 照培养基照培养基细细细细菌脱菌脱羧羧羧羧酶酶试验试验试验试验28（6）厌氧培养基培养基氧化还原电势低，有利于厌氧菌的生长。如庖肉培养基肉渣中含有谷胱甘肽及不饱和脂肪 酸，可降低氧化还原电势，吸收环境中的氧气， 从而造成缺氧状态。（7）特殊培养基如培养L型细菌及支原体的软琼脂培养基、孢子培 养基等。29小 结细菌学检验的样品有哪些类型？细菌检验样品的采集及运送原则不同类型培养基的灭菌要求有何不同？培养基的分类30
