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1、 封闭抗体与免疫治疗的 临床意义及应用深圳博爱医院 妇科钭妙莺最新情况w2010年6月12、13日中山大学孙逸仙纪念医院举办全 国女性生殖免疫最新进展学习班，共有16个省100多 家医院派出医生到场学习w2012年12月1516日深圳市举办的妇科内分泌学术会 ，张建平及刘庆芝分别对复发性流产的淋巴免疫治 疗进行了精彩的演讲。w生殖医学及免疫治疗已经成为时下国内医疗界最热门的 话题。w深圳各大医院及民营医院在复发性自然流产的免疫治疗 （LIT）领域目前已逐渐开展，其中包括深圳博爱医院 。概 况wRSA发病率：自然流产率5%2次自然流产率1%-5%，平均 2.3% 3次自然流产率0.34% 隐性流
2、产30%40% 总的自然流产率为50%60%50%原因不明，其中80%与免疫有关复发率：随着流产次数的增加而上升流产的病因w遗传因素w内分泌因素w解剖因素w感染因素w血栓前状态w精神、心理因素w免疫因素遗传因素w流产胚胎绒毛染色体核型分析w夫妇染色体核型分析w夫妇双方珠蛋白生成障碍性贫血wG6PD缺乏的筛查及基因检测内分泌因素w黄体功能不全w多囊卵巢缩合征w高泌乳血症w甲状腺疾病w糖尿病w检测项目有：性激素6项、甲状腺功能、胰岛素功能解剖因素w子宫畸形：纵膈子宫、单角子宫、鞍状子宫、双角子宫w子宫动脉阻抗增高w宫腔粘连w子宫肌瘤、子宫腺肌病w宫颈机能不全w检测方法：超声波、造影、宫腔镜、腹腔镜
3、检查感染因素w女性生殖道局部感染包括解脲支原体（UU）、衣原体 （CT)、加得纳菌（BV）、梅毒螺旋体（TP）、外周血 病毒感染等均可造成流产w检测项目：UU、CT、BV、TORCH 、TP等等血栓前状态w多种因素引起的凝血、抗凝和纤溶系统功能失调或障 碍的一种病理过程，有易导致血栓形成的多种血液学 改变。w常用检没项目有凝血常规四项：血检前状态分子标志 物，凝血酶原片断（F1+2），血栓调节蛋白（TM）， 凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）、抗凝血酶（AT ）、血小板颗粒糖蛋白140（GMP140）、血栓烷B2 （TXB2）、D二聚体（D）、纤溶酶原激活物抑制 物（PAI）精神心理因素w焦虑、紧
4、张、恐吓等严重精神刺激均可导致流产。w常期脑力劳动孕妇较强烈的长期或反复的精神紧张 、焦虑、烦躁等情绪变化，使大脑皮质兴奋抑制过 程的平衡失衡，舒缩血管中枢受影响，子宫小动脉 痉挛，绒毛缺血，胎儿发育障碍。免疫因素w一、自身免疫型1、抗心磷酯抗体（APL）2、抗核抗体（ANA）3、抗精子抗体（ASA）4、抗子宫内膜抗体（AEA）5、抗卵巢抗体（AOA）6、抗滋养细胞抗体（ATA）7、 RH血型抗体免疫因素w二、同种免疫型1、保护性抗体缺陷（封闭抗体阴性）2、淋巴细胞紊乱（NK细胞增多）封闭抗体的概念w封闭抗体：在正常孕妇的血清中，存在一种抗配偶淋巴细 胞的特异性IgG抗体，它可抑制淋巴细胞反应
5、（MLR），封 闭母体淋巴细胞对培养的滋养层的细胞毒作用，防止辅助T 细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚 胎的攻击。封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移 动抑制因子（MIF），故称其为封闭抗体（blocking antibodies，BA），或称为（Antipaternallymphocyte anti body，APLA)淋巴细胞免疫治疗的概念w淋巴细胞免疫治疗（LIT）：Beer和Tayor于二十世纪七十年代创立，并于1978年 开始应用于RSA的一种免疫疗法。对同种免疫型RSA患者彩 用丈夫或他人淋巴细胞进行同种致敏治疗，抑制母胎间的 细胞性免疫性排斥反应，减少流产率
6、。w对于封闭抗体和抗独特型抗体缺乏者，主要采用配偶淋巴 细胞免疫疗法，等到患者体内抗体水平升高时进行受孕， 妊娠的成功率可达到90%。免疫性自然流产分类w类：同种免疫型wHLA相容性升高，封闭抗体缺乏1、正常妊娠：父源性HLA抗原刺激母体，产生封闭抗体。母胎耐受，妊娠成功2、复发性流产夫妇HLADQA（DQAI）相容性过大，封闭抗体不产生。免疫攻击，自然流产3、特性：缺少封闭抗体，多次流产后可诱发、类免疫异常的流产4、淋巴细胞免疫治疗（LIT）是最理想的治疗方法免疫性自然流产分类w类：抗磷脂抗体APL（+）w抗磷脂自身抗体包括： 抗心磷脂抗体（ACL）、抗磷脂乙 醇胺抗体（APEA）、狼疮抗凝
7、血因子（CAC）、抗磷脂酰肌 醇抗体（APIL）、和抗磷酸抗体（APAA）。RSA患者APL（+ ）22%，每流产一次发生率增加15%。w特征：强烈的凝血活性、直接造成血管内皮细胞损伤、抑 制滋养细胞的功能w治疗：阿司匹林+肝素治疗免疫性自然流产分类w类：抗核抗体阳性ADA（+）和抗DNA抗体（+）。占 RSA妇女的22%，在不孕或IVF失败的妇女中占50%。w有自身免疫性疾病的妇女关节炎和器管炎症及无 自身免疫性疾病的妇女种植时胚胎周围发炎，种 植后胎盘发炎。w特征：对抗胎儿和胎盘DNAw治疗：强的松治疗，继发于关节炎或SLA者与风湿免疫 科一起治疗。免疫性自然流产分类w类：抗精子抗体ASA
8、和/或APL等组织特异性抗体阳性。 不孕、种植失败和RSA的病人约10%产生ASA。w特征：受孕困难w治疗：肝素+阿斯匹林+强的松治疗w下列情况需要检测ASA：1、抗丝氨酸中抗乙醇胺抗体阳性的妇女2、性交后试验不良的妇女（在宫颈粘液中精子死亡或不活动）3、配偶有ASA阳性免疫性自然流产分类w类：NK细胞数量和功能紊乱 w特征：CD56+、CD19+5+细胞数量或/和活性升高，分泌TNF 和抗神经转移因子抗体 w两类NK细胞可损伤妊娠CD56+产生TNF、损害蜕膜细胞和滋养细胞CD19+5+产生抗神经转移因子抗体，破坏滋养细胞产生的 激素（如雌激素、黄体酮和HCG） w不良结果： 妨碍种植（多次
9、种植失败）、损伤胎盘细胞、 损害孕囊（孕囊变形）、绒毛下出血（有时仅B起发现）、 影响卵细胞DNA，致胚胎质量不良 w治疗LIT、IVIg、代理妊娠免疫治疗w淋巴细胞免疫治疗（LIT）适应症1、类免疫紊乱（封闭抗体缺乏）2、不明原因RSA3、夫妇DQa相容性大，或夫妇间有2个或2个以上相同的 HLA抗原4、无抗父亲淋巴细胞毒抗体5、微细胞毒交叉试验阴性6、全身免疫状态正常7、夫妻双方均愿意接受治疗免疫治疗w淋巴细胞来源1、丈夫淋巴细胞2、 无关个体淋巴细胞3、血缘亲属淋巴细胞4、自身淋巴细胞免疫治疗w治疗方法1、配制淋巴细胞浓缩液2、淋巴细胞计数为：3410 7/ml3、双侧前臂皮内或皮下多点
10、注射（通常注射68针）4、每24周一次，每疗程4次5、封闭抗体上升，或微细胞毒交叉试验阳性即可受孕，受孕后继续LIT治疗35周期6、妊娠成功率达75%85%。封闭抗体检测w方法：ELISAw原理：用抗原包被微量板孔，制成固相载体，加患者血清 到板空中其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原 相结合，形成免疫复合物，除去多余的杂质后，加入辣根 过氧化物标记的IgG抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗 板，除去多余的结合物，加入底物，与其酶结合的免疫复 合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量 成正比。封闭抗体检测w操作步骤：1、实验前准备1.1 实验记录表上填写待检病人的详细资料，包括
11、姓名和编号。1.2 一块干板可同时人测十个样本，如不需检测十个样本，可用封板膜将无需使和的实难孔及对照孔封实2、实验操作封闭抗体检测2.1 90ulAntibody Diluent加入10Antibody Diluent,摇匀，加入第一行CH孔，第二行以CE孔，每孔 0ul.2.2 每份待检血清取20ul加入Antibody Diluent摇匀，分别加入312行AD孔（每人一人）每孔10ul.2.3 37孵育45分钟。2.4 配备1Wash buffer：取27ml蒸馏水加入3ml10Wash buffer，摇匀。封闭抗体检测w操作步聚：2.5 孵育45分钟后将反应板扣干，用1Wash buf
12、fer洗板两次，扣干。2.6 稀释酶标抗体：取594ul Antibody Diluent加入6ul Alkaline Phosphatase Conjugated (此为10人次所需试剂），摇匀。2.7 实验孔及对照孔均加入已稀释本科标抗体10ul，37孵育30分钟。封闭抗体检测2.8 扣干，用1Wash buffer洗板三次，扣干。2.9 各取Substrate A、B300ul，混匀，加入各孔10ul.2.10 避光孵育10分钟（37）。加入5ulStop Reagent终止反应。2.11 在已经设置好的酶标仪上进行读数，观察记录结果兰色为阳性，无色为阴性。（或都采用酶标仪读板） 。小
13、结w在反复性流产患者中，在排除如染色体遗传、内分泌 、生理解剖、感染、血栓等多种因素外，免疫因素是 反复流产发病的重要病因。w免疫困素分为自身免疫型和同种免疫型，封闭抗体缺 乏是导致免疫性反复流产的主要原因。w淋巴细胞免疫治疗在临床应用方面治疗反复性流产取 得显著成效。我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w信息资料：w取我院2010年12月-2012年12月不明原因早期自然流产 （包括生化妊娠，IVF-ET种植失败）及胚胎停育2次或2 次以上，且临床筛查确诊为封闭抗体缺乏所致的RSA患 者共80例，愿意接受淋巴细胞免疫治疗者40例列为治疗 组，采用淋巴细胞主动免疫进行治疗(LIT)。另40例作
14、 为对照组，对照组采用传统保胎治疗（黄体酮加HCG） 。 我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w本研究淋巴细胞免疫治疗应符合下列条件：w（1）封闭抗体检查阴性；w（2）生化妊娠及早期（12W前）自然流产史2次，或胚 胎停育2次，或自然流产+胚胎停育2次；w（3）夫妇双方染色体检查正常，无家族遗传病史我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w（4）双方行TORCH（包括巨细胞病毒、风疹病毒、单纯 疱疹病毒和弓形体）、梅毒、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎 检查均为阴性；w（5）生殖道衣原体、支原体、淋球菌等检查均为阴性；w（6）内分泌检查、甲状腺功能及空腹血糖正常我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w（7
15、）抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗心 磷脂抗体均为阴性；w（8）排除生殖道畸形和形态学异常；w（9）男方精液分析正常；w（10）治疗前3个月内未使用过调节免疫功能药物，未经 任何免疫治疗。我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w淋巴免疫的治疗方法：w无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静 脉血20ml，肝素抗凝；w在无菌条件下分离淋巴细胞；w将淋巴细胞悬液装于注射器中，给予患者两前臂内侧行 多点皮下或皮内注射，每侧注射3-4点，共68点。我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w每2-3周治疗1次，4-6次为一疗程。 w治疗一疗程后复查封闭抗体，若已转为阳性，要求3-5个 月内尽
16、快妊娠。 w确诊妊娠后，再加强LIT一疗程（2-3周1次共4次）至妊 娠14-16周。 w若转阳后半年内仍未能妊娠，应每隔8-10周巩固1次LIT ，以使封闭抗体不转阴。 w部分复查封闭抗体阴性者，再加强LIT治疗2次,若仍未转 阴也可考虑备孕。 我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w注意事项： w1.严格掌握适应证，应全面细致地检查，不可滥用； w2.RSA病因复杂，往往是多因素的，在诊治方面应全面考 虑综合治疗； w3.虽然LIT疗效成功率高，可达90%，治疗有效，但并非 神话，治疗后仍然还有一些妊娠失败的病例，与患者知 情沟通非常重要，签署知情同意书。我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会w4.双方上午空腹抽血，患者避开月经期，有生病情况者 ，过一周或数周治疗，治疗时避孕，治疗后观察半小时 ，严密观察有无腹痛、腰痛及阴道流血等，无不适离院 ； w5.1疗程结束后3周复查封闭抗体，阳性者尽快妊娠，未 孕者则每3月后加强治疗1次； w6.一旦妊娠，及早安
