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1、实验一：LB固体/液体培养基 及质粒提取试剂的配制一、实验目的l通过本实验，掌握常用LB液体/固体培养基 和质粒提取试剂的配制方法和技术，为后 续实验做准备二、实验仪器l电子天平lpH酸度计l磁力搅拌器lTOMY SS-325/245自动蒸汽灭菌锅电子天平FA/JA系列 称量范围：0200g 读数精度：0.1mg（FA2004）1mg（JA2003） 称盘直径：80mm（FA2004）110mm（JA2003） 预热时间：120min（FA2004）60min（JA2003）u将天平置于稳定的工作台上，避免振动、阳光 照射和气流u使用前观察水平仪，使水泡位于水平仪中心u接通电源，开始通电工作（
2、显示器未工作）， 通常需预热后方可开启显示器，进行操作使用uON开启显示器键/OFF关闭显示器键/TAR清零、 去皮键pH酸度计210A酸度计u标准配置：210A主机1台，9V电池1块，910600pH电极1支， pH4.01缓冲液，pH7.00缓冲液，pH10.01缓冲液uMode键用来改变模式：MEASURECALIBRATESETUPu用蒸馏水冲洗电极，用纸巾把电极附着的水分吸干，然后将电 极插入第1点缓冲液（pH7.00），均匀搅拌缓冲液u按mode键至屏幕上部显示CALIBRATE，屏幕下部出现74， 表示用7.00和4.01的缓冲液校正，按no键可以选择710/SET/7/7 4u
3、当屏幕下部显示74或710时，压yes键确认u屏幕出现P1，当屏幕出现ready时，第1点校正完成，压yes键确 认，仪器进入准备第2点校正，屏幕出现P2u将电极从第1点缓冲液中取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，将 电极插入第2点缓冲液，均匀搅拌缓冲液，当屏幕出现ready时， 第2点校正完成，压yes键确认，屏幕显示电极2点校正后的斜率值 ，仪器自动回到测量状态u将电极取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，即可测量样品溶液磁力搅拌器（配搅拌子）TOMY SS-325/245自动蒸汽灭菌锅l检查排放蒸汽的水壶，使腔体内的水位与 托板齐平lSET键设置温度和时间（121，20min）l关闭排气阀，Sta
4、rt机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行l程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排 气至压力为0。温度降至80以下压力为0 时方可开盖。运行过程中勿接触盖子l腔体内经常清洁lLB液体培养基 25ml/2瓶+50mL/3瓶lLB固体培养基（150ml/2瓶）每150ml液体培养 基中加2.25g琼脂l溶液（pH8.0，100ml）l0.4mol/L NaOH（100ml）l2SDS（100ml）l溶液（pH4.8，100ml）l70乙醇（100ml）l50TAE（200ml）溶液三、试剂配方及配制的操作步骤76，79页（1） LB液体培养基 将胰蛋白胨（typto
5、ne） 10g 酵母提取物（yeast extract）5g 氯化钠 10g 完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至 7.0，加入去离子水至总体积为1L，121湿热灭 菌20min。冷却后4保存备用。（2） 固体LB培养基：每升LB培养基中加15g琼脂1. LB1. LB液体液体/ /固体培养基固体培养基（76页）2. 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/mL溶 液，置20冰箱保存。3 3 溶液溶液 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L TrisHCl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 称量溶解调节pH值定容灭菌4 4 溶液溶液 0.4mol
6、/L NaOH 2%SDS 用前等体积混合。 称量溶解定容5 5 溶液溶液 (pH4.8) (pH4.8)5mol/L 乙酸钾 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL79页6 70%乙醇：放置于20冰箱保存，用后即放 回。7 胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5)、 15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL浓度，于 100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于 20。8 平衡酚(pH8.0) (购于申能博彩公司)9. 50TAE（500mL）121g Tris碱 28.55mL 冰乙酸 50mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)四、试剂灭菌lLB液体/固体培养基l溶液l50TAE 实验课20人每班 试剂配制时： 25mL LB液体培养基/100mL锥形瓶，4瓶/10人 溶液、溶液、溶液，1套/10人 50TAE，500mL/30人实验分组五、思考题l分子生物学实验中，为什么要对器具和耗材等进 行清洗和高温湿热灭菌？如果不灭菌，可能会对 实验产生怎样的影响？l怎样配制LB液体/固体培养基？l用碱裂解法提取质粒，在配制溶液、溶液、 溶液时，为什么要使用pH酸度计调节三种溶液 的pH值？lTOMY灭菌锅的使用注意点有哪些？
