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1、酶 工 程Enzyme Engineering第第 五五 课课酶酶 分分 子子 修修 饰饰Modification of Enzyme MoleculesModification of Enzyme MoleculesEnzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“什么是酶分子修饰“酶分子修饰（enzyme molecular modification）“通过各种方法使酶分子的结构结构发生某些改变，从而改变酶的 催化特性催化特性的技术过程“酶分子工程（enzyme molecular engineering）“指按照酶的各种特性的需要，依据结构性能间的关系结构性能间的关系，在分 子水
2、平上实现酶的结构设计和操作“分子生物学水平：用基因工程方法对 DNA 或 RNA 进行分子改 造，以获得化学结构更合理的酶蛋白“一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨 基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等?Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“对酶进行分子修饰的原因和依据“在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用“生理最适温度、pH 值 体外最适温度、pH 值值“酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差“酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著“理论论依据和方法“酶的结结构特点与酶催化特性的关系：构效关系构效关系“理性设计设计 （rational desig
3、n）：找出关键结键结 构，在掌握酶的构构 效关系效关系的基础础上，有目的地对对其进进行改造“半理性设计设计 （semi-rational design）：以基因的随机重随机重组组组组为为 手段，参考酶的构效关系进进行关键键位点的改造Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“酶分子修饰的意义：我们究竟要做什么？“应用角度 酶工程“提高酶的催化效率效率，改变底物专一性专一性“增强酶的稳定性稳定性，降低 / 消除酶的抗原性抗原性“研究角度 酶学“研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系“探测酶活性必需氨基酸的性质和数目“探索酶分子的拓扑学
4、及寡聚酶的亚基结合状态“探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动“探索酶的作用机理和催化反应历程催化特性催化特性环境适应性环境适应性Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“酶分子修饰的条件“修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团“pH 值与离子强度“决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态“修饰反应的温度与时间“严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应“反应体系中酶与修饰剂的比例“控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰Enzyme Engineering
5、 酶 分 子 修 饰“化学修饰的方法学揭示了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系揭示了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系 邹氏作图法邹氏作图法 袁勤生袁勤生, ,现代酶学现代酶学p139p139Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“化学修饰的方法学Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“酶分子修饰的种类“金属离子置换修饰（重点重点）“大分子结合修饰（重点重点）“侧链基团修饰（重点重点）“亲和修饰“肽链有限水解修饰（重点重点）“核苷酸链有限水解修饰“氨基酸置换修饰“核苷酸置换修饰“酶分子的物理修饰“酶的定向进化修饰Enzyme Engine
6、ering 酶 分 子 修 饰“金属离子置换修饰“Metal ion substitute modification“把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性 发生改变的修饰方法“通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化 机制“适用对象：金属酶金属酶（metalloenzyme）“一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 辅因子辅因子“金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起 稳定作用“金属酶纯化时仍保留着定量定量 的功能金属离子Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“金属离子置换修饰“常见的金属酶及其离子种类“-淀粉酶 Ca2+
7、、Mg2+、Zn2+“谷氨酸脱氢酶 Zn2+“过氧化氢酶 Fe2+“酰基氨基酸酶 Zn2+“超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+“细胞色素 P450 单加氧酶 Fe2+“固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)“谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV)“主要的金属离子“Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等Cyt P450Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“金属离子置换修饰“金属离子置换修饰的方法“酶的提纯“除去原有金属离子“加入金属螯合剂金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA 形成螯合物“透析、超滤或层析除去螯合物“加入置换的离子“加入含另一种金属离子的溶
8、液，酶蛋白与其结合“用透析或层析等方法除去未结合的离子Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“金属离子置换修饰“金属离子置换修饰的作用“阐明金属离子对酶催化作用的影响“一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶 / 辅基可逆结合，从 而起到催化作用“提高酶的催化效率“将 Zn 型-淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高 20%30%“增强酶的稳定性“Fe-SOD 置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低“改变酶的动力学特性“酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被 Co 置换后，酶的底物专一性 （Km 值）和最适 pH 都显著改变Enzyme Engineering
9、酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“Macromolecules combine modification“采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合共价结合，使酶分子的空 间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法“常用的大分子“糖、糖的衍生物“聚乙二醇（PEG）“含 C=C 双键单体聚合得到的聚合物“多肽链，甚至蛋白质Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“大分子结合修饰的方法“选择修饰剂“选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子“聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等“修饰剂的活化“将修饰剂分子中的基团（OH）转化为高反应性的基团“修
10、饰反应“将活化过的修饰剂与纯化的酶液按照一定比例混合反应，控制温 度、pH 等条件“分离“层析分离，除去多余的修饰剂Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 聚乙二醇（聚乙二醇（polyethylene glycolpolyethylene glycol，PEGPEG）“PEG 既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂“微毒或无毒“免疫原性低“生物相容性好，已通过 FDA 认证“分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大“末端有两个能被活化的 OH 基团“为了获得单功能的PEG，将其中一个羟基转化为烷氧基，即单单 甲氧基聚乙二醇（甲氧基聚乙二醇（MPEGMPEG
11、）Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 MPEG“三氯均三嗪活化法（重点掌握）三氯均三嗪活化法（重点掌握）Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 MPEG“叠氮法：将OH转化为N3 基团Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 MPEG“琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 MPEG“重氮法：将OH转化为N=N 基团Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂
12、 右旋糖酐（dextran）“右旋糖酐是由葡萄糖通过 -1,6-1,6-糖苷键糖苷键 形成的高分子多糖“水溶性较好“生物相容性好“糖链上的 2,3-2,3-双羟基双羟基 经活化后可与酶分子中的氨基结合Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 右旋糖酐“溴化氰（CNBr）法：糖酐活化Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 右旋糖酐“溴化氰（CNBr）法：与酶偶联Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 右旋糖酐“高碘酸（高碘酸（HIOHIO4 4）氧化法）氧化法Enzyme
13、Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 右旋糖酐“高碘酸（HIO4）氧化法：增加连接臂Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 肝素（heparin）“由 D-葡萄糖醛酸（或 L-艾杜糖醛酸）和 N-乙酰氨基葡萄 糖形成重复二糖单位组成的多糖“在体内外都有抗凝血作用“临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心 脏导管检查、体外循环、血液透析等Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“修饰剂 肝素“碳二亚胺法（COOH 反应）Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大
14、分子结合修饰“修饰剂 肝素“三氯均三嗪法Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“大分子修饰的作用 提高酶的催化效率“根本原因：改变了酶的空间构象空间构象，有可能促使酶活性中心与 底物更容易结合“酶的催化功能是由其空间结构决定的“例1：1 分子核糖核酸酶与 6.5 分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原 有的 2.25 倍“例2：1 分子胰凝乳蛋白酶与 11 分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效 率提高到原酶的 5.1 倍位阻效应位阻效应Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“大分子修饰的作用 增强酶的稳定性“水溶性大分子与酶结合，在酶
15、分子外层形成保护层保护层，可以保护 酶的空间构象“不溶性大分子与酶结合，形成固定化固定化 酶，也提高酶的稳定性“稳定性的表征 半衰期半衰期“酶的半衰期：酶活力降低到原来活力一半时所经过的时间酶的半衰期：酶活力降低到原来活力一半时所经过的时间大分子修饰酶大分子修饰酶半衰期半衰期相对稳定性相对稳定性 天然天然 SODSOD6 min6 min1 1右旋糖酐右旋糖酐-SOD-SOD7 h7 h7070 FicollFicoll( (低分子量低分子量)-SOD)-SOD14 h14 h140140 FicollFicoll( (高分子量高分子量)-SOD)-SOD24 h24 h240240 PEG-
16、SODPEG-SOD35 h35 h350350Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“大分子结合修饰“大分子修饰的作用 降低或消除抗原性降低或消除抗原性“酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内 产生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原 的酶特异地结合，使酶失去催化功能“经过大分子修饰，酶蛋白的空间结构发生改变，致使酶蛋白与酶蛋白的空间结构发生改变，致使酶蛋白与 抗体之间不再发生特异性识别抗体之间不再发生特异性识别，从而降低了酶蛋白与体内抗体 的结合几率“例如：L-天冬酰胺酶 EC 3.5.1.1 经 PEG 修饰后抗原性显著降低 ，已经在 1994 年被 FDA 批准用于治疗急性淋巴性白血病Enzyme Engineering 酶 分 子 修 饰“侧链基团修饰“Side residues
