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1、治疗侏儒治疗侏儒 症症的的唯一唯一 方法：方法：向向 患者注射患者注射 生长激素生长激素加拿大袖珍女童肯娜迪加拿大袖珍女童肯娜迪( (4 4 岁，岁，6666厘米高厘米高) )就像父亲手就像父亲手 中的中的“ “玩具洋娃娃玩具洋娃娃” ”。 侏儒症侏儒症 现在利用基因工程方法：将人 的生长激素基因导入大肠杆菌 中，使其生产生长激素。人们 从 450 L大肠杆菌培养液中提 取的生长激素，相当于6万具 尸体的全部产量。450L450L大肠杆菌培养液提取的大肠杆菌培养液提取的生长生长 激素激素相当于相当于6 6万具尸体的全部产量万具尸体的全部产量解剖提取法解剖提取法基因工程法基因工程法耗财财耗时时6
2、万X8千=4.8亿几十万至少一年最多半个月第十六章第十六章 基因工程及其在医学中的应用基因工程及其在医学中的应用 是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。一一. .基因工程的概念基因工程的概念 (genetic engineering)第一节第一节 基因工程基因工程 限制性核酸内切 酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶（一）工具酶二、二、 基因工程操作中常用的工具基因工程操作中常用的工具限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义:是一类能识别D
3、NA的特异序列, 并在识 别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。G CCTAGGATCCG+GGATCC CCTAGGBam H型限制酶识别序列特点回文结构 GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG一般识别双链DNA的48个核苷酸顺序 ，其中以6个核苷酸顺序最为常见。 Bam HGTC CAGG CCTAGGATCCG+GGATCC CCTAGGHind GTCGAC CAGCTGGAC CTG+平端切口粘端切口（二）目的基因（二）目的基因(target gene)(target gene) 定义：指基因工程研究中，感兴趣的基因或 DNA。 例如： 控制智商的基因控制智商
4、的基因控制胖瘦的基因控制胖瘦的基因1.定 义：是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。 2.分 类：(1)克隆载体:使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。(2)表达载体:使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链的载体。（三）基因载体（三）基因载体质粒 (plasmid) 特点n存在于细菌等细胞质中n双链环状DNA分子n大约 1-200 Kbn具有自主复制和转录能 力n不能独立存活n 在子细胞中保持恒定 的拷贝数并表达其遗传 信息常用载体：细菌质粒、噬菌体、黏粒、病 毒、酵母人工染色体、细菌人工染色体等特点： 多克隆位点 筛选标记三、基因工程的操作过程三、基因工程的操作过程基
5、本过程目的基因的获取重组DNA分子 导入宿主细胞目的基因与载体的连接克隆(或表达)载体的选择和构建重组体的筛选与鉴定克隆基因的表达 和表达产物纯化以质粒为载体的 DNA克隆过程1. 化学合成法2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(PCR)（一）目的基因的获取化学人工合成化学人工合成1）已知目的基因的核苷酸序列2）已知目的基因表达产物的氨基酸序列基因组 DNA文库cDNA文库1.粘性末端连接 （三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和构建方法也不同。 Ba
6、m H切割反应GGATCCCCTAGGT4 DNA连接酶 15CGATCCGG CCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端导导入种类类载载 体宿 主转转 化质质 粒细细 菌转转 染噬菌体或病毒真核细细胞感染噬菌体细细 菌转化、转染和感染的区别转化、转染、感染是将重组DNA导入到宿主细胞的过程，宿主细胞的形状发生改变，重 组DNA得以复制、扩增。（四）重组DNA导入宿主细胞Bam H切割反应GGATCCCCTAGGT4 DNA连接酶 15CGATCCGG CCTAG+目的基因用
7、 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选(插入失活法) 抗药性标记选择重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入宿主细胞 筛筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物限制酶消化 开环载体DNA目的基因连接酶 重组体 转化体外包装，转染 带重组体的宿主筛选表型筛选酶切
8、电泳鉴定菌落原位杂交种 类类功 能所含特异序列 克隆载载体 外源基因扩扩增 复制子 多克隆位点 筛选标筛选标 志 表达载载体 外源基因表达 复制子 多克隆位点 筛选标筛选标 志 基因表达的调调控序列克隆载体和表达载体的比较（六）克隆基因的表达常用的分子生物学技术常用的分子生物学技术 The Common Used Techniques in Molecular Biology第二节一、核酸分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Techniquen核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果
9、把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。（一）分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA1、印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 2、探针技术NC膜DNA或RNA探针（二）印迹技术的类别及应用1、DNA印迹 (Southern Blotting)2
10、、RNA印迹 (Northern Blotting)3、蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。分子杂交实验n核酸序列分析的基本原理 ： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法)二、DNA序列分析DNA Sequence Analysis三、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 末代沙皇尼古拉II 1918年的流行性感冒病毒 电影侏罗纪公园 辛普森杀妻案 （一）PCR 的故事上述四件事情到底有
11、什么相关呢？ 然而近二十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR） 答案是NO! PCRPCR最大的特点是能最大的特点是能将将微量微量的的DNADNA大幅增大幅增加加。因此，无论是化。因此，无论是化石中的古生物、历史石中的古生物、历史 人物的残骸，还是几人物的残骸，还是几 十年前凶杀案中凶手十年前凶杀案中凶手 所遗留的毛发、皮肤所遗留的毛发、皮肤 或血液，只要能分离或血液，只要能分离 出出一丁点一丁点的的DNADNA，就，就 能用能用PCRPCR加以放大，加以放大，进行比对。这也是进行比对。这也是“
12、 微量证据微量证据”的威力之的威力之 所在。所在。 PCRPCR的发明人，一般公认是穆里斯（的发明人，一般公认是穆里斯（K. K. MullisMullis），他因此获得了），他因此获得了19931993年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。Kary Banks Mullisthe Pacific Coast HighwayPCRPCR的点子的点子，据穆里斯，据穆里斯 的说法，那是在的说法，那是在19831983年年 春天的一个周五晚上，春天的一个周五晚上， 他开车带着女友前往乡他开车带着女友前往乡 间的小屋度周末。在蜿间的小屋度周末。在蜿 蜒的乡间公路上开着车蜒的乡间公路上开着车 ，一段一段D
13、NADNA反复复制的反复复制的 景像景像，在他的脑海里冒，在他的脑海里冒 了出来。穆里斯原以为了出来。穆里斯原以为 这样简单的想法，应该这样简单的想法，应该 有人提出过，但搜索文有人提出过，但搜索文 献后却发现没有。献后却发现没有。变性95 C延伸 72 C退火Tm-5 C 1. PCR的基本反应步骤（二）PCR技术的工作原理及应用 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+2.2.PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分黄石公园的热泉黄石公园的热泉19731973年台湾科学家年台湾科学家钱嘉韵钱嘉韵从黄石公园热泉里一种嗜从黄石公园热泉里一种嗜热菌中成功分离出耐高温热菌
14、中成功分离出耐高温的的TaqTaq DNA DNA聚合酶。聚合酶。 ThermusThermus aquaticusaquaticus5Primer 1 5Primer 2Cycle 2Cycle 1555555Template DNA3. PCR技术的工作原理5555 5555Cycle 35555 5555 555555 552530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。4. PCR技术的主要用途生命学科生命学科医学工程医学工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断法医学法医学考古学考古学四、转基因技术和核移植技术The transgenic and nuclear transp
15、lantation techiniques转基因技术转基因技术多多 利利 诞诞 生生 过过 程程核转移技术1、克隆人的身份难以认定，他们与被克隆者之间的关 系无法纳入现有的伦理体系。 2、人类繁殖后代的过程不再需要两性共同参与，这将 对现有的社会关系、家庭结构造成难以承受的巨大冲击 。 3、克隆人技术可能会被滥用，成为恐怖分子的工具。 4、从生物多样性上来说，大量基因结构完全相同的克 隆人，可能诱发新型疾病的广泛传播，这对人类的生存 是不利的。 5、克隆人可能因自己的特殊身份而产生心理缺陷，形 成新的社会问题。 克隆人的弊端第三节第三节基因工程在医学中的应用基因工程在医学中的应用The app
16、lication of Gene engineering in Medicine MstII酶切位点553 突变基因1.15Kb 0.20Kb1.35Kb正常基因一、基因诊断利用分子生物学和分子遗传学的技术方法 通过直接检测基因结构是否改变、基因表达有 否异常，对疾病作出诊断。 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析3+ 0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析二、基因治疗将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。第一例基因治疗腺苷脫氨酶缺乏症第一例基因治疗腺苷脫氨酶缺乏症n n病因病因: :n淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能
