基因工程的基本操作程序 (2)

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1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个基因工程基本操作的四个步步骤骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予 一种生物以另一种生物的遗传 特性。使目的基因在受体细胞中稳 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达 ，才能实现一种生物的基因 在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。一、目的基因的获取 1目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业

2、用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。 2获取目的基因的常用方法： 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成1. 从基因文库中获取目的基因1. 1. 基因文库的概念基因文库的概念: :将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2. 2. 基因文库的种类基因文库的种类: :基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库

3、某种生物某个时期的mRNA基因文库的构建方法 基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法： 提取某种生物的某器官 或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶 结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区调

4、控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶 结合位点基因结构原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_ 的，边_ 边_编码区是间隔的、 _的，先_ 后_相同点都由能够编码蛋白质的_和具有 调控作用的_区组成的连续 不连续编码区 非编码转录 翻译转录 翻译思考？真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？基因组DNA文库与cDN

5、A文库的比较文库类库类 型 cDNA文库库 基因组组文库库文库库大小基因中启动动子（具有 启动动作用的DNA片段 ）基因中内含子(位于编编 码码蛋白质质序列的非编编 码码DNA片段）基因多少物种间间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因 某种生物的全部基因可以部分基因可以2.利用PCR技术扩增目的基因 1概念： PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 2原理：DNA复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷 酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应 体外特定DNA片段3前提： 已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）： 双链DNA模板在热

6、作用下， _断裂，形成_b、退火（复性55-65） ：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部 _。 c、延伸（70-75）：在 Taq酶的作用下，合成与模板 互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一 次，目的基因增加_倍一PCR技术扩增与DNA复制的比较 DNA复制PCR技术术场场所原理条件解旋方式酶特点结结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模 板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、 模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、 边解旋边复制半保留复制、 全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的

7、DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、 解旋酶等3. 人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合 成的目的基因含内含 子、启动子和终止子 吗？人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法 肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种 类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库二、基因表达载体

8、的构建 基因工程的核心 1目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可 以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。 2基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因表达载体启动子：位于基因的首端的一段 特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶 识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得 蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段 特殊的DNA片断，能终止mRNA的 转录标记基因的作用是为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因，从而 将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口 获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质

9、粒）同一种一个切口 两个黏性末端注意：载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞 1转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。 2常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。 3目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵

10、染细胞的途径。1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入 稳定维持和表达过程：1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将 包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体 细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法 。 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在 0.64um 。适用：单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方

11、法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花 粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入 DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通 道进入受体细胞 特点:十分简便经济。例：转基因抗虫棉2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法 程序 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+2+处理获得感受态细胞过程：CaCa2+2+处理处理 大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA表达载体表达载体 与感

12、受态与感受态 细胞混合细胞混合小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到 Ti质粒的T-DNA上 农杆菌导入植 物细胞整合到受 体细胞的DNA表 达将含有目的基因 的表达载体提纯 取卵（受精卵 ）显微注射 受精卵发育获 得具有新性状的 动物Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载 体与感受态细 胞混合感受 态细胞吸收DNA 分子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体

13、细胞很少。 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定 维持和表达？ 不一定，需要检测不一定，需要检测1、鉴定分子水平的鉴定转基因生 物的DNA探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了 目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNADNA分子分子方法 DNA分子杂交技术变性变性变性变性1、鉴定分子水平的鉴定变性变性方法 分子杂交技术（2 2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA探针15N N15N N转基因生物 的mRNA14N N14N

14、 N1、鉴定分子水平的鉴定提取（3 3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法方法抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注 射小鼠体内从小鼠血管抽出 血液分离出抗Bt 毒素的抗体抗体蛋白质出现 杂交带脱分化组织培养2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。思考？不能，受体细胞必须表现出特定的性不能，受体细胞必须表现出特定的性 状，才能说明目的基因完成了状，才能说明目的基因完成了表达表达

15、。受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基分子后就说明目的基因完成了表达吗？因完成了表达吗？课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是( )A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是( )利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.D课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料资料D D【拓展深化】 工具酶只有两种