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1、目录基因重组和基因工程基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering第14章目录第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用
2、重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录相关概念n DNA克隆n 工具酶n 目的基因n 基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系本节主要内容：目录一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。（一） DNA克隆目录 技术水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆） 细胞克隆个体克隆（动物或植物） 目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、
3、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有自我复制能力的DNA分子复制子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆目录 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录目录（二）工具酶 限制性核酸内切
4、酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别识别 特异序列，切割DNADNA连连接酶催化DNA中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸 二酯键酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连连接DNA聚合酶合成双链链cDNA分子或片段连连接 缺口平移制作高比活探针针 DNA序列分析 填补补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链链合成，双链链DNA 3末端标记标记 等反转录转录 酶
5、合成cDNA 替代DNA聚合酶I进进行填补补，标记标记 或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟羟基末端磷酸化，或标记标记 探针针末端转转移酶在3羟羟基末端进进行同质质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bam H 定义：目录、（基因工程技术中常用型） 分类： 作用： 1.是指能够特异识别双链DNA序列并进行切 割
6、一类酶。 2.只降解双链DNA分子，不切割单链DNA； 具有序列识别特异性; 需要二价金属离 子Mg2+来激活。 3. 型限制性内切酶的识别特异性识别46个核苷酸的回文结构目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：Hin d属 系 株 序Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG目录Bam HGTC CAGG CCT
7、AGGATCCG+GGATCC CCTAGGHind GTCGAC CAGCTGGAC CTG+平端切口粘端切口目录 EcoRI -GAATTC- G.A之间切断成粘性末端-CTTAAG- -G AATTC-CTTAA G- SmaI -CCCGGG- C.G之间切断成平末端-GGGCCC-CCC GGG-GGG CCC-目录来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bam HGGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bst 同功异源酶：目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同
8、的粘性末端 ，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为 配伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBgBg l lGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAG CCTAGGATCCG+A TCTAGGATCTA 同尾酶名 称 识别识别 序列及切割位点名 称 识别识别 序列及切割点切割后产产生突出末端: BamH 5GGATCC.3 Bgl 5AGATCT.3 EcoR 5GAATTC.3 Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3 切割后产产生3突出末端: Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.
9、3 Kpn 5GGTACC.3 Pst 5CTGCAG.3 Sph 5GCATGC.3 切割后产产生平末端: Alu 5AGCT.3 EcoR 5GATATC.3 Hae 5GGCC.3 Pvu 5CAGCTG.3 Sma 5CCCGGG.3限制性内切核酸酶目录限制性内切酶的反应条件及注意事项（1）内切酶：a 低温保存，防止变性；b 加量适当；c 防止污染。（2 2）DNADNA样品：样品：有一定的纯度，不能含有有一定的纯度，不能含有酚、氯仿、酚、氯仿、SDSSDS及及10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA （3 3）反应缓冲液：反应缓冲液：PH. MgPH. Mg2+2+（4
10、4）酶解温度与时间酶解温度与时间：37370 0C 1-1.5C 1-1.5小时小时目录（5 5）反应体系混匀与反应终止）反应体系混匀与反应终止 离心离心 混匀。混匀。 终止：终止：a: a: 加入加入EDTAEDTA至至100mmol/L100mmol/L除去除去Mg2+Mg2+或加或加 入入0.1%SDS0.1%SDS（W/VW/V） 酶变性酶变性. .b: b: 加热使酶灭活加热使酶灭活. .c: c: 用酚用酚/ / 氯仿抽提去蛋白，乙醇沉淀。氯仿抽提去蛋白，乙醇沉淀。 （6 6）酶解结果鉴定：）酶解结果鉴定：微型琼脂糖电泳，紫外灯下观察。微型琼脂糖电泳，紫外灯下观察。目录n 限制性内
11、切酶酶解中常出现的问题：n（1）DNA未被切割或切割不完全内切酶失活或非最佳条件。n（2）酶切后未观察到DNA片段存在无或未混匀n（3）电泳后，DNA片带弥散不清，不均一内切酶星号活力或其它核酸酶污染。目录Taq DNA聚合酶 从极度嗜热的栖热水生菌Thermus aquatics 中纯 化得到。T最适=75-80, 用于PCR反应，DNA序列 分析。 连接酶 T4DNA连接酶：不仅可以连接大片段DNA的粘性末 端，也可用于平末端的连接。 要求：双链DNA中的切口，形成磷酸酯键。目录末端脱氧核苷酸转移酶使DNA链3-OH端加脱氧核苷酸，用于同聚 物加尾或DNA 3-OH端标记。 目录碱性磷酸酶
12、： 催化单链或双链DNA和RNA的5端脱去磷酸的反应。 用于 （1）DNA 5末端标记32-P时，去除磷酸基。 POH 3OH *P53OH HOP HO HO35P*（2）防止自身环化：防止载体自身连接，用碱性 磷酸酶去除载体5末端的磷酸基。目录（三）目的基因(target gene)：所要克隆并进行研究的基因。cDNA (complementary DNA)指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA 或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为 模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息( 染色体及线粒体)的所有D
13、NA序列。 目录（四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的 一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA目录 克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。目录二、重组DNA技术基本原理 基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 以质粒为载体的 DNA克隆过程目录（一）目的基因的获取n化学合成法
14、 要求：已知目的基因的核苷酸 序列或其产物的氨基酸序列 。n基因组DNA文库(genomic DNA library)ncDNA文库(cDNA library)n聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 目录化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文 库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L 左臂R cos 右臂真核生物染 色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos
