基因工程与分子生物学常用技术

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1、第十五章第十五章 基因工程与基因工程与分子生物学常用技术分子生物学常用技术 Genetic Engineering and The Popular Technology In Molecular Biology()分子生物学技术现已广泛渗透到生命科学和医 学等多个学科中，尤其推动了基因工程的发展。 对疾病的发病机制、诊断及药物生产等领域取 得了令人瞩目的成就，对医学的发展起着巨大的推 动作用。第一节第一节 基因工程与基因重组基因工程与基因重组(Genetic Engineering and Genetic recombination) 一、基因工程的基本概念不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯

2、键连 接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。将基因进行克隆，并表达制备特定的产物， 或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法 及相关的工作统称为基因工程。(一)工具酶 1. 1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1) (1) 能够切割能够切割DNADNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，中磷酸二酯键的酶称核酸酶， 其中有选择地切割其中有选择地切割DNADNA分子特异序列的核酸酶，分子特异序列的核酸酶， 称为称为限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。，简称限制性内切酶。(2)(2)命名命名Hin d属 系 株 序Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的

3、第三种酶(3)(3)识别特征识别特征5GAATTC3 3CTTAAG5限制性内切酶识限制性内切酶识 别的别的DNADNA序列具有序列具有回回 文结构文结构特征。特征。不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果 有3种不同的情况：产生产生3 3 突出粘性末端突出粘性末端：以：以EcoEcoR R为例：为例：5G5GAATTC3 AATTC3 5G5G AATTC3 AATTC3 3CTTAA3CTTAAG5 G5 3CTTAA3CTTAA G5 G5产生产生5 5 突出粘性末端突出粘性末端：以：以PstPst为例：为例：5CTGCA5CTGCA G3 G3 5CTGCA5CTGCA G3 G

4、3 3G3G ACGTC5 ACGTC5 3 G3 G ACGTC5 ACGTC5产生产生平末端平末端：NruNru为例：为例：5TCG5TCGCGA3 CGA3 5TCG5TCG CGA3 CGA3 3AGC3AGCGCT5 GCT5 3AGC3AGC GCT5 GCT5(4)(4)切割位点切割位点2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶(1)(1)基因工程主要应用基因工程主要应用E.coliE.coli DNADNA聚合酶聚合酶、T4 T4 DNADNA聚合酶和聚合酶和TaqTaq DNA DNA聚合酶等。聚合酶等。(2)(2)主要用途：主要用途：利用利用5 5/ /33/ /聚合活性，合成聚合活

5、性，合成DNADNA第二条链；第二条链；对对DNADNA的的3 3/ /端进行填补或末端标记；端进行填补或末端标记；E.coliE.coli DNA- DNA-polpol用于缺口平移，制作探针；用于缺口平移，制作探针；T4 DNAT4 DNA聚合酶可用于聚合酶可用于DNADNA序列测定；序列测定；TaqTaq DNA DNA聚合酶用于聚合酶链式反应聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)(PCR)。3.DNA3.DNA连接酶连接酶 使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。4. 4.逆转录酶逆转录酶 (1)(1)用于真核用于真核mRNAmRNA逆转录，构建逆转录，

6、构建cDNAcDNA文库。文库。 (2)(2)用于进行用于进行3 3/ /端填补和标记，制备端填补和标记，制备DNADNA探针。探针。 (3)(3)用于用于DNADNA序列测定。序列测定。 5. 5.多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (1)(1)用于放射性标记用于放射性标记DNADNA链的链的5 5/ /端。端。(2)(2)用于缺少用于缺少5 5/ /- -磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化。磷酸化。6. 6.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 此酶防止载体的自身连接。此酶防止载体的自身连接。7. 7.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 能催化单核苷酸转移到能催化单核苷酸转移到DNADNA的的3 3/ /-

7、-端羟基上。端羟基上。(二)载体 1. 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意 义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。2. 载体的选择标准能自主复制。 易进入宿主细胞。 具有多克隆位点。 易从宿主细胞中分离纯化。 有易被识别和筛选的标志。质粒 噬菌体 粘粒粘粒 病毒3.常用载体质粒是细菌中独立于质粒是细菌中独立于 染色质以外的、能自主染色质以外的、能自主 复制的、并与细菌或细复制的、并与细菌或细 胞共存的遗传成分，胞共存的遗传成分，可 赋予宿主细胞某些遗传 性状。通常质粒的大小为通常质粒的大小为2 2 300kb300kb。一般只能容纳一般只能容纳10kb10kb的的 外源外源DNAD

8、NA片断。片断。(1)(1)质粒质粒(plasmid)(plasmid)(2)(2)噬菌体噬菌体( (bacteriophagebacteriophage，phage)phage) 噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌 中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNADNA注注 入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 具有具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。(3)(3)粘粒

9、粘粒 ( (cosmidcosmid) )粘粒本身约粘粒本身约4 4 6kb6kb，可克隆，可克隆DNADNA大片段，可大片段，可 用作建立真核基因组文库的载体。用作建立真核基因组文库的载体。粘粒是将粘粒是将 噬菌体的噬菌体的coscos区与质粒组合的装配型区与质粒组合的装配型 载体。载体。(4)(4)病毒病毒病毒载体更多病毒载体更多 地用于真核表达系地用于真核表达系 统，如腺病毒、痘统，如腺病毒、痘 病毒、反转录病毒病毒、反转录病毒 和猴空泡病毒。和猴空泡病毒。二、重组DNA技术的基本原理和过程基因工程中最主要是基因工程中最主要是分子克隆分子克隆，克隆克隆是指由是指由 一个细胞经过无性繁殖后

10、所形成的子代群体。进一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进 行分子克隆所采用的技术即重组行分子克隆所采用的技术即重组DNADNA技术，故又技术，故又 称为分子克隆技术或基因工程技术。称为分子克隆技术或基因工程技术。制备目的基因和相关载体；将目的基因和载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达。 基本步骤基本步骤( (一一) )目的基因的制备目的基因的制备1. 1. 制备基因组制备基因组DNADNA文库文库 (genomic library)(genomic library)将基因组将基因组DNADNA酶切成片段，再与载体分子拼接酶切成片段，

11、再与载体分子拼接 成重组成重组DNADNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分 子克隆混合体称基因组文库。子克隆混合体称基因组文库。2. 2. 制备制备cDNAcDNA文库文库 ( (cDNAcDNA library) library)将将mRNAmRNA逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA ，再与载体连接成，再与载体连接成 重组重组DNADNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分 子克隆的混合体称为子克隆的混合体称为cDNAcDNA文库。文库。3. 3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)如已知目的基因序列，则可

12、采用如已知目的基因序列，则可采用PCRPCR从从 基因组基因组DNADNA中获得目的基因，也可以采用逆中获得目的基因，也可以采用逆 转录转录PCR (RT-PCR) PCR (RT-PCR) 直接从直接从mRNAmRNA获得特定基获得特定基 因的因的cDNAcDNA。4 4化学合成化学合成 如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应 密码子推导出密码子推导出DNADNA的碱基序列，然后合成该的碱基序列，然后合成该 段段DNADNA序列。序列。( (二二) )目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接1 1粘性末端连接粘性末端连接 2 2同聚物加尾连接同聚物加尾连接 3

13、3平末端连接平末端连接 4 4人工接头连接人工接头连接将目的基因插入载体，用将目的基因插入载体，用DNADNA连接酶连接双连接酶连接双 链链DNADNA粘性末端序列，在体外重新连接成人工重粘性末端序列，在体外重新连接成人工重 组体。方法主要有以下四种：组体。方法主要有以下四种：( (三三) )将外源将外源DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞常用的方法有以下两种：常用的方法有以下两种：1. 1.转化转化(transformation) (transformation) 转化是指将质粒或其他外源转化是指将质粒或其他外源DNADNA导入处导入处 于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的于感受态的宿主

14、细胞，并使其获得新的表型的 过程。过程。2. 2.感染感染(infection) (infection) 感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进 入宿主细胞中繁殖的过程。入宿主细胞中繁殖的过程。1.遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性 标志基因(ampr、tetr 、kanr等)和目的基因而 设计的筛选方法。 2.分子杂交方法 利用32P标记的探针与重组DNA或克隆 DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目 的基因。 3.免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异 结合的方法筛选。( (四四) )目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定( (五五) )克隆基因的表达克隆基因的表达利用重组利用重组DNADNA技术所获得目的基因或技术所获得目的基因或DNADNA序列序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生，可实现在受体细胞中的表达，即产生mRNAmRNA或蛋或蛋 白质产物。白质产物。( (六六) )重组重组DNADNA技术操作过程总结归纳技术操作过程总结归纳 分 切 接 转 筛分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体 2. 特点 针对性强、特异性强、灵敏度高、 适应性强。三、基因诊断和基因治疗1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法， 直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从 而对疾病作出诊断的方法。(一)基