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1、DNA重组（目的基因的获得）第四章 限制性核酸内切酶（工具酶已经介绍）一、DNA分子片段化天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的 DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶 切、双酶切和部分酶切等方法。单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品 。最常用。双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种 DNA分子。部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在 DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。DNA分子的限制性图谱 限制酶图谱（ restriction map）: 描述染色体上限制性 内切酶切割位点之间 距离和顺序的图谱。二、 特异性DNA片段的PCR扩增聚合酶链式反应（
2、polymerase chain reaction）即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年发明，又称基因的体外扩增法。也有人称无细胞分子克隆法。 PCR技术的用途 目的基因的扩增与分离； 医疗诊断； 基因突变与检测； 分子进化研究； 环境检测； 法医鉴定。（一）、基本原理变性 95C延伸 72C退火 Tm-5C909530137603017075302动画（二）、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件1、耐热性DNA聚合酶Taq DNA聚合酶(无校对功能)功能： 有5 3DNA聚合酶活性， 5 3DNA外切酶活性 无3 5 DNA外切酶活性特点：活性在pH9左右（20）和温度75 左
3、右的反应条件下 最高，95 处理后仍保持活性；即使100 处理5min，仍具一半活性Pwo DNA聚合酶(有校对功能)功能：有5 3DNA聚合酶活性，3 5 DNA外切酶活性无5 3DNA外切酶活性特点：耐热性更高， 100 处理2h，仍具一半活性；准确度比Taq DNA聚合酶高10倍；扩增的DNA片段是平末端的。Tth DNA聚合酶(RT-PCR)功能：有强5 3DNA聚合酶活性；无3 5 DNA外切酶活性特点：Mn2+存在时，有强反转录酶活性，RNA cDNAMg2+存在时，cDNA可继续进行PCR扩增可被用于反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增至少1000bp长的cDNA片段C.
4、therm. DNA聚合酶 (RT-PCR、有校对功能)功能：有5 3DNA聚合酶活性；3 5 DNA外切酶活性特点：Mg2+存在时，有反转录酶活性，RNA cDNA合成cDNA的准确度比Tth DNA聚合酶高2倍Taq DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶 将喜温性细菌中此酶的基因转入E.coli细胞 ，市售产品为此酶基因在E.coli细胞中的表达产物。Tth DNA聚合酶，C.therm. DNA聚合酶直接从发现它们的微生物中提取2、靶 DNA 和模板靶 DNA：待扩增的特定DNA双链片段。应该知道其两端2030bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。模板：一条单链的DNA片段3、PCR引物(
5、Primer) PCR扩增引物：是指与待扩增DNA区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片 段，其长度通常在1624个核苷酸之间。 它包括引物1和引物2。 引物设计的基本原则是最大限度地提高 扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特 异性扩增。具体的设计原则： 引物3端必须具有游离-OH基团； 引物长度20-30个核苷酸，G+C含量一般为40%60%，四种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在 ； 引物应避免回文结构，同时引物之间也不能有互补性 ， 避免形成引物二聚体； 5端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光 素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝 对不能进行任何修饰，因
6、为引物的延伸是从3端开始的。 扩增编码区域时，引物3端不要终止于密码 子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率 ； 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续8个互补碱基同源 4、PCR原材料dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP或修饰过的核苷酸5、PCR缓冲液140mM Tris-Hcl（pH8.8）、4 8mM MgCl2、40mM (NH4)2SO4、30g/ml BSA(无核酸酶)、牛血清蛋白(BSA） 16mM DTT 二硫苏糖醇DL-Dithiothreitol 中文名为二硫苏糖醇 分子式为C4H10O2S2 分子量为154.25 常用还原剂
7、，有抗氧化作用。DTT和巯基乙醇 相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很 多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯 基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT 价格略高一些。还原性 DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度 上是由于其氧化状态六元环（含二硫键）的构 象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33 伏。 应用 DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保 护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚 体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低 了一些偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定） 的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除 去
8、，就可以降低DNA的二聚化。 DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于 阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或 分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构 内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常 需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，根据DTT存在情 况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的 深浅。6、PCR循环的温度和时间 （1）变性（快速高温） 温度：90 95 ，多采用94 时间：20s（2）复性 温度：取决于引物长短和GC含量 如长度20个核苷酸，GC含量50% 55 ； 如长度12 15个
9、核苷酸 40 45 ； 时间：20s（3）延伸 温度： 70 75 时间：随扩增DNA片段长度而定 1000bp1min，150bp甚至不需考虑延伸时间l平台效应出现的迟早 主要取决于起始模板 的拷贝数、所用的 DNA聚合酶的性能及 底物dNTP的浓度等多种因素。7、PCR扩增的平台效应 在PCR反应中，当引物模板与DNA聚 合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的 反应趋于饱和，会出现“平台效应”，即 PCR反应产物不再增加。（三）、PCR扩增DNA片段的方法 P59（四）、常用的DNA片段PCR扩增 系统P60三、DNA片段的化学合成化学方法合成的DNA片段DNA互补链的引物、寡核苷酸连杆基
10、因片段基因元件合成DNA互补链的引物除PCR引物外，还有测序引物。见下表。DNA寡核苷酸连杆（linker）linker：是指用化学方法合成的一段由812个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与另一有相同粘末端的DNA片段连接。由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别序列，可作为连杆且被组装在克隆载 体上成为多克隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。MCS连杆衔接头（adaptor）adaptor：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平 末端的特殊的双链寡核苷酸短
11、片段。4. DNA4. DNA芯片芯片是是DNADNA片段以预先片段以预先设计的排列方式固设计的排列方式固定在载玻片或尼龙定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分膜上组成的密集分子排列子排列。四附：实验技术 DNA片段大小的凝胶电泳检测核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA 片段u 优点：（1）便于分离（2）便于检测（3）便于回收 核酸凝胶电泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离 子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中 ，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持 介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦 系数成反比
12、。而摩擦系数是分子大小、介质粘度 等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但 构型有差异的核酸分子。 方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳等。 条件：中性或偏碱性的缓冲系统，DNA带负 电。 运动方向：DNA经过凝胶分子筛移向正极。 迁移率影响因素：DNA分子的大小和构型， 与DNA碱基组成和顺序无关。一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状（开环分子 ）。 检测：溴化乙锭染色，紫外光下发红色荧光 。一、琼脂糖凝胶电泳参数凝胶缓冲液和电泳缓冲液常用： TAE（Tris-醋酸 ）、TBE（Tris-硼酸
13、） 、 TPE（Tris-磷酸 ）都是常用电泳缓冲液。 TAE是使用最广泛的缓冲系统。 其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量 （TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质 量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲 液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取 得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。 TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化不可选用，除 非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用 TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离
14、效 果更好。TBE缺点是用于琼脂糖凝胶时易造成高 电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共 价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回 收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 TPE的缓冲能力也较强，但缺点是由于磷酸盐易 在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA 片段的电泳中使用。凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳 的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率 向阳极迁移。凝胶中琼脂糖含量凝胶中琼脂糖含量 检测大片段检测大片段DNADNA的琼脂糖含
15、量小，反之则大。的琼脂糖含量小，反之则大。加加DNADNA样品样品 一般一般1g1g以下，多了会使大小接近的以下，多了会使大小接近的DNADNA带不易分带不易分 开，少了会影响小片段开，少了会影响小片段DNADNA带的检测。带的检测。电泳条件电泳条件 注意：靠加样孔一侧为负极。注意：靠加样孔一侧为负极。 电压：电压：1 110V/cm10V/cm（依据分辨力要求、（依据分辨力要求、DNADNA片段大片段大 小和电泳时间决定）小和电泳时间决定）凝 胶 的 EB 染 色溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）染色和紫外观察）染色和紫外观察络合物使用EB染色注意事项（1 1）EBEB是很强的是很强的诱变剂诱变
16、剂，操作时应带手套！，操作时应带手套！溴化乙锭溶液必须经处理后才能废弃。溴化乙锭溶液必须经处理后才能废弃。（2 2）EBEB可用来检测可用来检测单链或双链单链或双链核酸核酸（3 3）EBEB使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用EBEB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存液，于室的贮存液，于室温保存在温保存在棕色瓶棕色瓶或用或用铝箔铝箔包裹的瓶中，使用终包裹的瓶中，使用终 浓度为浓度为0.5 0.5 gg/ml/ml 。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。微波炉实验仪器琼脂糖凝胶电泳槽凝胶成像 系统DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红
