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1、http:/ 作作 流流 程程琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备质粒质粒DNADNA及酶切产物电泳（约及酶切产物电泳（约1h1h）（10 10 l l）酶切操作、保温（）酶切操作、保温（1-3h1-3h）质粒质粒DNADNA提取原理与方法、提取原理与方法、实验操作实验操作纯化的质粒纯化的质粒DNADNA（2020 l l）琼脂糖凝胶电泳结果观察琼脂糖凝胶电泳结果观察结果分析与问题讨论结果分析与问题讨论9月23日9月30日DNA的紫外分光光度法定量测定 http:/ 实验四：实验四：DNADNA的紫外分光光度法定量测定的紫外分光光度法定量测定http:/ 备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯
2、酰胺电泳http:/ bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 http:/ 在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 http:/ bromophenol bl
3、ue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 http:/ 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 2、 琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。http:/ DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动
4、速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。4、 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 http:/ 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电
5、泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 http:/ 七、设备 水平式电泳装置,电泳仪, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。 八、 试剂 1、 5TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加 入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 2、 6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v) 蔗糖 水溶液（或30 甘油），贮存于 4。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔 或黑纸包裹容器,储于室温即可。http:/ 1、 取5TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成
6、0.5TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、 胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60，而后到入制胶模具（预先插上样品梳子）中，待胶完全凝固后拨出梳子 ，取出胶块，放入加有0.5TBE 电泳缓冲液的电泳槽内。http:/ 加样：取8lDNA样品与2l 6载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即
7、接通电源。控制电 压保持在60-80V,电流在40mA以上。电泳方向由负极向正 极，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/ml的EB 溶液中,室温下染色5-10分钟。 7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染 色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或 有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。http:/ 注意事项1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制板变形2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔3 点样时枪头下伸，
8、点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4 Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔5 紫外线照射不要太久http:/ 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 实验结果酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果 。http:/ 型质粒DNASC 质粒DNA细菌RNAhttp:/ 掌握752型紫外分光光度计的使用；学习用紫外分光光度法测定DNA的含量。http:/ 灵敏度高：测定下限可达105106mol/L 准确度 能够满足微量组分的测定要求：相对误差25 （12）操作简便快速应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的 特性而建立起来的分析方法。http:/ 可见见近红红外中红红外 远红远红 外 （真空紫外 ） 10nm200nm 200nm380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m300 mhttp:/ 橙 黄 绿 青 蓝 紫单色光三棱镜可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源高低http:/
