第十章重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选

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1、重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选? 第一节 重组DNA向宿主细胞的导入 第二节 转化子的筛选与鉴定 第三节 目的基因序列测定第一节 重组DNA向宿主细 胞的导入一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导 入宿主细胞 1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎 球菌的转化试验感受态细菌是指细菌处于容易接受外源 DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候 自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生 长期发生，如E.coli。产生机制不明。一是原 生质体假说，另一是酶受体假说。转化作用就是一种基因型细胞

2、（感受态细 菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细 胞的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传 性发生相应变化的现象。常见转化方法有 原生质体转化法； 化学转化法； 电穿孔法。 原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA， 经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2 经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli 。 1.原理：将对数生长期的细菌在0下, 用预冷的 CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞 膜通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进 入细菌的细胞内 。用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形 ，外源DNA被

3、吸附，经短暂42热休克，易于 进入胞内而不被降解，转化效率达105106，它 与菌株（hsdR). 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5于2ml LB中 37，振荡过 夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90至OD6000.2 离心（5K，5 ） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20 离心 收集菌体 加入100ul100mM预冷CaCl2 混匀转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNAlng100ul b阴性对照10ul2ul连接液100ul c阴性对照10ul100

4、ul d连接液转化组60ul6ul连接液600ul （2）转化： 0，在1.5ml离心管中按下表加入 CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验冰浴30 42 2（热休克） 冰浴，2 加37预热LB培养45 表中a、b、c各取100ul/ 皿涂布（连接液转化组d梯度涂布 I 50ul2皿； II.500ul浓缩后2皿） 37倒置培养过夜 检查细菌生长情况电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表 面形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙 而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（ 一般可达1091010个转化子g DNA ）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且适用

5、 于任何菌株。 二、通过接合作用传递质粒DNAF质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复 制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质 粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F菌株 。F+菌株（供体菌）一旦与F菌株（受体菌）发 生接触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F菌株 ，使F菌株转变成 F+菌株。质粒由F+向F菌的转 移过程叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递 。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重 组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发 生接合传递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F菌 也可获得F质粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克隆

6、载体。接合- F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、通过转染/转导作用传递遗传物质 转染病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细 胞（或细菌）的过程称转染。 转导以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转 导。 原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA, 体外包装成噬 菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重 组噬菌体DNA导入宿主菌体内第二节 转化子的筛选与鉴定一、利用遗传标志的表型特征筛选 二、根据重组子的结构特征筛选一、利用遗传标志的表型特征筛选 由载体提供的性状进行筛选 1. 抗菌素抗性标记筛选 2. 抗性

7、基因的插入失活筛选 3. 半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选 法及其 -互补的原理 根据插入基因的遗传性状进行筛选亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长， 当 含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来 筛选阳性克隆。Ampicillin 抗性? yes yesTetracycline 抗性? No yesB X BBBXAmproriAmpr TcroriAmprTcroripBR322Bbacktransfer of colonies+ampicillin+ ampicillin + tetracycline这些克隆是有重组质粒的细菌编码b-半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶

8、的底物)lac promoter蓝色菌落IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主 细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性的 -半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的 肽链失去活性, 使其不能形成-互补, 因此带有外源基 因重组子的细菌形成白色菌落。 非重组质粒: 不含有插入的 DNA蓝色菌落重组质粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落back非重组质粒重组质粒-互补的原理所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的 突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变 体2带有完整的近操纵基因而无半

9、乳糖苷酶活性），它 们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之 间通过肽互补作用可呈现有功能的半乳糖苷酶活性, 进 而可分解底物Xgal（5溴4氯3吲哚D半乳糖苷）而 产生半乳糖和深蓝色的底物5溴4氯青定蓝, 使菌落呈现 出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中 LacZ 肽区段的多克隆位点后, 就会阻断序列的读码结 构, 使其编码的肽失去活性, 使重组子所在的细菌不能完 成互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落 。根据这种半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出 携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图5 1二、根据重组子的结构特征筛选 1. 重组子大小鉴别筛选

10、 菌落提取质粒 单酶切电泳原质粒 2. 酶切鉴定 菌落提取质粒 双酶切电泳原质粒 3. PCR筛选法能与插入基因片断两端互补的特异引物, 以少量抽提的重组子 DNA为模板, 进行PCR分 析 4. 原位杂交 图53、54该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法 。 5. 斑点杂交 1)重组体DNA或RNA抽提出来, 麻烦 2)抽提纯化, 蛋白质、 杂DNA等减少, 所以能得到 更为确切的结果, 既可用于定性,对拷贝数进行 相对定量。 6. Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中 是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位

11、于基因同尾酶BamHI和BglII AGATCT GGATCCTCTAGA CCTAGGBgl BamHIA GATCCTCTAGT4连接酶 G AGATCC TCTAGG肺炎双球菌转化实验第三节 目的基因序列测定 一、目的基因序列测定的意义美国联邦国家人类基因组研究 项目负责人弗朗西斯柯林斯博士在华 盛顿隆重宣布，人类基因组序列图绘制 成功，人类基因组计划的所有目标全部 实现。由美、英、日、法、德和中国科 学家经过13年努力共同绘制完成了人类 基因组序列图，在人类揭示生命奥秘、 认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的 一步。 二、目的基因测序方法 酶法双脱氧链的末端终止法 化学（裂解）法酶法双脱

12、氧链的末端终止法1. Sanger双脱氧末端终止法：因掺入ddNTP的 链不能再延长而形成不同长度的末端为A、G 、C、T的片段。图55 2. Sanger双脱氧M13体系测序法：采用M13噬 菌体组装基因后，再由引物合成不同长度末 端为A、G、C、T的片段 图56 3 .Sanger双脱氧PUC体系测序法：类似M13体 系，只是由PUC体系替代M13噬菌体，再由 引物合成不同长度末端为A、G、C、T的片 段。图57 双脱氧M13体系DNA序列分析法 M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA （RF）。成熟的噬菌体含单链DNA分泌到培 养液中。 双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法 从细菌中制备 单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取目前常用的M13mp18 图56 化学（裂解）法在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱 基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。 加入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件 下，硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加 入甲酸可在A、G处断开，形成G+A组，最 后电泳经感光读片，自动分析得到测序结 果。如、图59 510全自动DNA测序仪 末端终止法，采用4种荧光染料标记 ddNTP，在同一泳道测序，为人类基因 组测序做出重大贡献。