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1、 第四章植物细胞培养及次生产物代谢生产一、悬浮培养二、单细胞培养三、植物细胞的规模化培养及有用物质生产一、悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。1、愈伤组织诱导要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松 散易碎。适于悬浮培养 适于再生植株如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性好
2、、细胞状态好的细胞不断继代培养。悬浮系建立过程 ：影响悬浮细胞生长的因素：1、 起始愈伤组织的质量2、 接种细胞密度3、培养条件：方式、温度、4、 继代周期2、悬浮系的建立与继代培养愈伤组织1g愈伤/10ml培养基 150、250ml三角瓶（30、70ml培养基）120rpm,25黑暗培养, 换液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养80rpm（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为1周时（ 原悬浮液：新培养基=1：4 ）每次继代都要进行选择，筛选生活力好的细胞继代成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件： 1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一 般在 305
3、0个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系 。 2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加1倍。3、悬浮细胞生长动态：基本的悬浮培养体系 均是将细胞分散在一 定容积的培养液中进 行，在一个培养周期 不添加培养基。这种 培养体系基本是处于 封闭状态。当一种营 养物质耗尽时，细胞 及停止生长。在这种 悬浮培养体系中，细 胞扩增生长成S形曲 线。培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，
4、称为一个培养周期。 接种初期的细胞密度过低会使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在（0.52.5）*105个范围内调整。一般继代培养可降低密度；若在短时间内获得大量细胞可提高接种密度。在实际应用中，还需要确定一些参数：最低起始密度、最大生长速率、每个培养周期所经历的天数等。4、悬浮细胞培养的同步化细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同 一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。饥饿法：在一个培养体
5、系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分 裂受阻，从而停留在某一分裂时期。抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞。低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。二、 单细胞培养1、平板培养2、看护培养3、微室培养4、双层滤纸培养悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。1、细胞平板培养平板培养(plate culture)：将
6、一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5105ml。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约12mm。封口：用石蜡膜封培养皿。平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率：能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。植板率（） 每个平板形成的细胞团数每个平板接种的细胞总数平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度和培养基成分互相依赖（负相关
7、）。镜检：用倒置显微镜观察将单细胞做标记 ，已获得真正的单细胞系。培养： 25黑暗培养。2、看护培养看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。操作方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其 迅速生长3、微室培养它可对单细胞进行活体连续观察。这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。4、双层滤纸培养Horsch等（1980）将平板培养与饲 养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植 板培养方法。三、 植物细胞大规模培养及有用物质生产（一
8、）、概述（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（三）、利用细胞培养生产有用物质 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。（一）、概述植物产生代谢产物的类型根据分子结构不同大致分为：酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸 生氰甙多炔类、有机酸植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，
9、目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。 自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式 生产周期 紫草宁含量（干重）完整植物 23年 12植物细胞培养 3周 14植物次生代谢产品的市场潜能产品成分 用途 年销售额（亿美元 ）长春花碱 治疗白血病 1820（美国）奎宁 治疗疟疾 510（美国）致热素 杀虫剂 20（全世界）毛地黄 心脏病药 2055（美国） 植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生
10、长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。（二）、植物细胞规模化培养体系的建立1、种子细胞的选择（1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；（2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官为外植体；(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将 单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，1份成分含量分析，另1份保留培养。2、种子细胞系的增殖与放大培养种
11、子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。3、大规模培养体系的建立（1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。（2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。(3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。(三)生物反应器类型及特点大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采用
12、的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜
13、空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。 生物反应器Stirred Tank BioreactorsAn external motor is used to agitate the growth medium with impellers.Sterile air or combinations of gases can be introduced (sparkling)气压搅拌式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。 Bu
14、bble Column Bioreactor (Airlift Reactor)Introduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenationInternal Loop Airlift BioreactorTube placed inside the reactor creates internal circulation loop External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 旋转式培养系统一般用
15、于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。 固定化培养系统 这一技术的优点在于：可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研 究特定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所 处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度， 有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可 以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初 生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中 ，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而 节省了生产细胞所付出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的
16、介质中，并可以从培养基 中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。细胞固定化培养技术按照其支持物不 同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统：支持物多采 用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等 ；附着式固定化培养系统：支持物采用 尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 1、利用细胞培养生产有用物质的一般程序（1）选材 应注意以下条件：药效肯定；对其有效成分有充分的了解；有测定有效成分和药理的可靠方法； 市场短缺或价格昂贵； 取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。（四）、（四）、利用利用细胞培养生产有用物质细胞培养生产有用物质（2）细胞株系建立将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。 在工厂化生产中，为了提高有用
