昆虫病原细菌的利用

第十七章 昆虫病原细菌的利用Bacterial entomopathogens1细菌杀虫剂的特点（筛选生防菌的依据）（1）有选择性即对防治对象毒力高，而对植物、益虫以及哺乳动物等无毒，不污染环境；（2）稳定性高，易剂型化；（3）致病因子多样化，不易产生抗性；（4）可通过基因工程等手段改造菌株；（5）可结合其它防治手段进行综合管理；（6）可以大规模生产，成本低2第一节 昆虫病原细菌的主要类群一般生物学特征：真细菌：G+，G，支原体；主要集中在芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、肠杆菌科、奈瑟菌科等；三阶段：延滞期、指数生长、静止期亚种、菌株差异致病相关基因以基因族形式存在，毒素基因大多在质粒上3感染、致病和传播从口部进入：突破障碍（口部唾液、肠道围食膜、肠道菌群）引发毒血症和败血症早期症状：停止取食、麻痹、腹泻、呕吐等后期症状：组织坏死、体色变化、虫体变软变形、有恶臭液体流出4根据昆虫病原细菌的特性和致病所需条件可分为：一、专性病原细菌Obligate entomopathogenic bacteria经口部至消化道感染专化性高，难以人工培养如天幕毛虫芽孢杆菌Clostridium malacosomae5二、兼性病原细菌（Facultative entomopathogenic bacteria ）一类可在人工培养基上正常生长发育的细菌。

包括产芽孢和不产孢的杆菌如蜡状芽孢杆菌寄主范围较广细菌在寄主消化道内增殖，并侵入体腔内，造成寄主染病死亡有些种类能产生毒素，如引起细菌性中毒病的苏云金杆菌以及能引起灵菌败血病的粘质沙雷氏菌等6三、潜在病原菌（Potential entomopathogenic bacteria ）多数为腐生菌，普遍存在于昆虫的消化道中如铜绿假单胞菌由于毒素和酶的产生数量少，难以侵入体腔内给宿主造成危害作为寄主的昆虫种类很多，不是特定昆虫种的病原体能引起家蚕细菌性败血病和细菌性肠道病的一些细菌便属于这一类7昆虫病原细菌的主要类群:芽孢杆菌属（Bacillus）: Bt；金龟子芽孢杆菌；球 形芽孢杆菌梭状芽孢杆菌属（Clostridium）：天幕虫梭菌假单胞菌属（Pseudomonas）：铜绿假单胞菌赛氏杆菌属（Serratia）：灵杆菌变形杆菌属（Proteus）肠杆菌属（Enterobacter）沙门氏菌属（Salmonella）葡萄球菌属（Staphylococcus）8第二节 苏云金杆菌ü苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称B.t. ）最早发现于1901年，1938年世界上第一个苏云金 芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世，1970年初开始 商业化应用。

ü使用广泛，例如，苏云金杆菌已经成为加拿大控制 枞色卷蛾（spruce budworm）的主要手段在其它 国家，苏云金杆菌运用于控制毛虫（caterpillar）、 舞毒蛾（gypsy moths）等ü目前，全世界约有苏云金芽孢杆菌杀虫剂100多个品 种，年销售额近1亿美元9一、基本特征（一） G+的好气性 芽孢杆菌生活史3个阶段1. 营养体以苏云金亚种为例，营养体大小1.2 ～1.8×3.0 ～5.0µm，两端钝圆，周生鞭毛，能运动营养体横裂生殖，对数生殖期往往2、4、8个或更多的营养体连在一起成串状营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体102. 芽孢囊期在形成芽孢的同时，在菌体内的一端或两端能形成 具蛋白质性质的一个、两个乃至多个菱形、方形、 长方形、椭圆形、镶嵌形或不规则形的伴孢晶体， 是其主要的活性成分伴孢晶体由不同分子量的多肽——原毒素（protoxin ）组成113. 芽孢和伴孢晶体的释放芽孢囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢（0.8~0.9µm2.0µm）和伴孢晶体（0.6µm 2.0µm ）芽孢是细菌的休眠体，对高温、干燥等不良环境条件有较强的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期贮存。

芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体1213（二）培养特征可在多种培养基上生长菌落：蛋白胨琼脂平板上，30ºC培养24小时，形成针尖状黄色小点，边缘平滑72小时后，圆盘状，直径1cm，表面干燥平坦，边缘不整齐，略显放射状皱纹菌苔：凸突状，乳白色或淡黄色，光滑或有皱纹，可产生可溶性褐色素14（三）生理特征对营养要求不高碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆等无机盐：磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙温度：27~32°CpH：略偏碱，7.5需氧15（四）生态特征土壤微生物，分布广（除了南极洲未发现）；◦ 在土壤优势种影响下，增殖停滞；◦ 土壤类似于Bt芽孢的存储空间；在昆虫体内环境下利于其遗传物质交换和增殖；◦ 有些菌株与寄主形成内共生关系，通过产生抗生物质帮助寄主抑制病原菌或分泌分解酶助消化；商用菌株多采自叶面死虫16（五）感病特征Type I and II hosts are characterized by a fast onset of gut paralysis continuing in type I to a general paralysis correlating with an increase in the pH and potassium concentration in the hemolymphWhile both type I and II hosts are susceptible to crystal toxin alone, type III hosts do not develop paralysis and require the presence of spores for mortality. 17二、类群分类到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的3000种有害生物有活性。

根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性，苏云金芽孢杆菌可划分为71个血清型86个亚种ü 鞭毛抗原血清型（H-血清型，H亚因子）：国际咨询中心编号ü 酯酶型：无鞭毛菌株1819苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的 致病性和毒力的差异 苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大属于不同血清型的亚种或具有相同血清型的不同亚种的寄主范围是不同的毒力的大小与产生的毒素有关，也与细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关这对工业生产中有效菌株的选择以及高毒力或其他特异性菌株的选育具有重要意义20三、苏云金杆菌的毒素和致病机理（一） 苏云金杆菌的毒素苏云金杆菌产生的毒素分为两大类：一类是内毒素，即伴孢晶体内所含毒素；另一类是外毒素，是细菌在生长过程中分泌在菌体外的代谢产物苏云金杆菌所产生的毒素主要是β外毒素和δ内毒素211. 杀虫晶体蛋白——丁体内毒素（δ- endotoxin）是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素通常又被称为：◦ 伴孢晶体（Parasporal crystal）、◦ 伴孢晶体包含体（ Parasporal crystal inclusion body）◦ 晶体蛋白（Crystal protein）、◦ 晶体毒素（Crystal toxin）、◦ 杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICPs ）晶体蛋白须在昆虫中肠碱性条件下经蛋白酶的消化作用裂解为有作用部分和无作用部分，只有有作用的部分或核心才能算丁体内毒素。

22晶体的形成与芽孢的形成有密切关系•能抑制芽孢形成的化合物如醋酸氟也能抑制晶体的形成，•特定情况下相对独立如在低温（14～15℃）培养条件下不能形成芽孢，但晶体仍能产生•形态各异：双锥形、球形、立方体型、扁矩形、不规则形、长菱形•杀虫结晶蛋白基因表达产物，基因位于质粒(1~20个)上，部分在核染色体上，野生菌株一般含有多个编码ICP的基因23伴孢晶体的成分B.t.的伴孢晶体包涵体中含有一或多种杀虫晶体蛋白，按一定方式聚合成晶体结构， 晶体不溶于水和有机溶剂，可溶于碱性溶液虽属热敏感毒素，但具有一定的耐热性，在65℃中可保持1h，80℃下20 min也不致破坏，80～100℃下30 min可被破坏晶体由18种氨基酸组成，各亚种在氨基酸的组成上是相同的，其含量也相近，可见不同亚种对昆虫表现出的不同毒力可能存在于结构单位之中24根据杀虫活性和基因同源性分为5类 ：cry I：鳞翅目昆虫cry II：鳞翅目和双翅目昆虫cry III：鞘翅目昆虫cry IV：双翅目昆虫cyt：其它动物，27种基因25Bt Toxin Nomenclature Committee website (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crick more/Bt/)cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac杀虫毒力最高262. 营养期杀虫蛋白VIP截至2009年，共发现65个vip基因甲体外毒素（α-exotoxin）是一种能被热破坏的（120℃，20min）蛋 白质，在菌体培养对数期的后期，先于芽孢和 晶体的形成产生。

口服能使某些害虫中毒273.乙体外毒素（ β-exotoxin）又称苏云金素、热稳定外毒素、蝇毒素，能 忍耐121℃(15min)的高温和对家蝇幼虫有毒 性β外毒素是一种腺嘌呤核苷酸衍生物，相对 分子量约为700，它是苏云金芽孢杆菌在一 定培养条件下所产生的细胞外毒素，可溶于 水，苏云金素是广谱毒素，对较多目的昆虫有毒 性284、几丁质酶chitinase可溶性胞外蛋白质类杀虫活性物质一般作为杀虫剂的增效剂线形氨基多元醇类化合物可溶于水，对热敏感能抑制多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长， 对子囊菌和担子菌也有抑制作用5、双效菌素ZwA296. 免疫抑制因子A7. 自身诱导物抑制蛋白8. Bacteriocin-like 抑制因子：细菌素30（二）苏云金杆菌致病机理B.t.对昆虫的致病作用是通过它所产生的毒素和芽孢而引起的ü 一般是伴孢晶体起作用使昆虫发生毒血症而死亡，即是由于晶体毒素对中肠上皮细胞作用结果，肠壁受损，中肠的碱性、高渗内含物进入血腔，血淋巴pH升高从而导致感病幼虫麻痹死亡ü 芽孢的存在不仅可提高Bt.伴孢晶体对昆虫的致病力，芽孢在肠道中萌发及与菌体一道通过由晶体毒素损坏的中肠肠壁进入血腔，菌体的繁殖引起昆虫败血症的发生，这也是感病昆虫死亡的原因之一。

31Bt晶体毒素引发疾病过程——家蚕0阶段：0~30 min 停止取食，活动正常，血淋巴pH和K+上升；I阶段：轻度迟钝，30~120min，中肠麻痹；II阶段：极度迟钝，2~3h，不能自主活动；III阶段：全身麻痹，3~4h，心跳完全停止最后死亡321. ICP的致病机理五环节：昆虫肠道溶解，酶解活化，与受体结合，膜 孔形成，细胞裂解 1)当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后，在中肠肠液碱性条件下打开二硫键溶解成原毒素，2)进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片断（toxic core fragment），3)才能与刷状缘（brush border）上特异性受体高亲和性地结合，4)快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔或损伤（lesion），并破坏钾、钠离子梯度，引起膜的非极性化，5) 细胞裂解，昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡33How do Cry toxins work?34ICP杀虫特异性与跟受体亲和力大小有关抗性的形成关于细胞裂解两种假说：◦ 质子崩溃假说◦ 渗透裂解假说352. 苏云金素的作用机理 ①是原核和真核生物DNA依赖的RNA聚合酶的特殊抑制剂，真核DNA依赖的RNA聚合酶比原核的更敏感②不直接影响蛋白质和DNA生物合成途经③影响合成核糖体RNA，对合成RNA的过程也有抑制作用。