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1、实验五 一些试剂对四膜虫影响的观察一、实验目的1、了解生存环境对生命的重要意 义。 2、比较各种因素对四膜虫细胞的 影响。二、实验原理细胞生存需要一定的条件。四膜虫也不 例外。其形态比较固定，细胞较大，它的 纤毛和伸缩泡及其本身都在不停的运动。 一旦条件发生变化，四膜虫所发生的反应 马上就可以被观察到。本实验通过一些常见的化学试剂，以不 同的浓度对四膜虫进行处理，观察较短时 间内细胞所产生的效应。1、酸和碱每种生物对环境的酸碱度都有一定的影响，水 生生物（包括四膜虫）和培养的组织细胞更是 如此。酸碱度超过一定的限度，对细胞的生存 不利，甚至会将其杀死！深海海水的酸碱度约为pH8左右。大面积的淡
2、水水域酸 碱度也较稳定，约在pH69之间。海洋和湖泊等水域有 较强的调节pH的能力。这是由于水域中存在着H2CO3和碳 酸盐的缓冲系统。即使局部地区发生了pH的变化，在一 定范围内经过一定时间也能通过这一缓冲系统而恢复正常。但是如果环境污染(酸雨、废酸排放)超过了水域的 调节能力，水域的pH就要发生变化，生物的生存和发育 就要受到影响。酸碱度的改变对生物的生长生殖和活动都能发生影响。例如，绿草履虫(Paramecium barsaria)，在酸 性的培养液中(pH6.06.3)，体长可达120m，在碱性培养 液中(pH7.68.0)，体长只有86m。海胆卵在pH6.2的水中不 能受精，pH低于
3、4.6时死亡。各种微生物都有其最适酸碱 度。酵母和霉菌适宜在微酸性环境中。也有少数可以在 强酸或强碱性环境中生存。 氧化剂可使蛋白质变性，破坏生物膜结构， 在浓度较高时能迅速杀死细胞。常用的消毒 剂如次氯酸钠、双氧水都是强氧化剂。 强氧化剂的杀菌作用： 强氧化剂容易同细菌的细胞壁中的脂蛋白或细胞膜中的磷脂质 、蛋白质发生化学反应，从而使细菌的细胞壁和细胞膜受到破 坏（即所谓的溶菌作用），细胞膜的通透性增加，且氧化剂迅速扩散进入细胞内，氧化了细胞内酶或RNA、DNA，从而致死菌 原体。 巯基乙醇是常用的还原剂，微量巯基乙醇可 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活 性中心受到破坏。 巯基试剂在生
4、化反应中有两个用途，一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境 。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物（如二硫苏糖醇DTT 、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巯基乙醇，谷胱甘肽也经常应用。 巯 基乙醇有毒！对环境有危害，对水体可造成污染 。2、氧化剂和还原剂去垢剂是一些具有亲水的极性基 团和疏水的非极性基团的长链分子。非离子型去垢剂如TritonX-100可与脂双层形成混合微团，它们主 要与蛋白质疏水部位相互作用， 一般不会引起蛋白质变性。而离 子型去垢剂与蛋白结合后可改变 蛋白质结构，使之变性，尤其是 加热后可使蛋白质解离为单体，如十二烷基磺酸钠（SDS）
5、等。3、去垢剂去垢剂能破 坏细胞膜结 构，造成细 胞损伤、功 能丧失，甚 至引起死亡 。非离子型 去垢剂通过 溶解膜上的 脂蛋白和磷 脂类化合物 等，使细胞 膜结构改变 。4、高渗溶液渗液压对细胞的影响：水通过细胞膜的运 动方向主要决定于细胞外环境的渗透压。在 正常情况下细胞外的渗透压与细胞内渗透压 处于平衡状态，细胞维持正常的形态与生理 功能。高渗液可使细胞失水，引起细胞形态/ 功能的改变；低渗液可使细胞膨胀，甚至破 裂。细胞膜具有对物质选 择透过的生理功能。脂溶 性越高通透性越大，水溶 性越高通透性越小；非极 性分子比极性容易透过， 小分子比大分子容易透过 。水分子可通过水通道 进出细胞膜
6、；非极性的小 分子如O2、CO2、N2可以 很快透过脂双层，不带电 荷的极性小分子，如尿素 、甘油等也可以透过人工 脂双层，尽管速度较慢， 分子量略大一点的葡萄糖 、蔗糖则很难透过，而膜 对带电荷的物质如：H+ 、Na+、K+、Cl、HCO3 是高度不通透的。不同分子透过人工脂双层的能力水通道是处于持 续开放状态的膜通 道蛋白，水分子的 转运不需消耗能量 ，也不受门控机制 影响。水分子通过 水通道的移动方向 完全由膜两侧的渗 透压差决定，水分 子从渗透压低的一 侧向渗透压高的一 侧移动，直到两侧 渗透压达到平衡。 第一个被发现的水通道蛋白APO1（引自http:/nobelprize.org/
7、）四膜虫为淡水性原生生物，有伸缩泡来调节 渗透平衡，耐低渗，但高渗对其有影响！可 注意观察在不同浓度蔗糖和NaCl溶液中细胞 发生的变化！5、有毒物质叠氮钠：剧毒，可强烈地抑制并阻断线粒 体中细胞色素电子运送系统。甲醛：能使蛋白质变性，常作为防腐剂、 固定剂使用。6、其他物质DMSO二甲亚砜， 是一种溶于水又 溶于有机溶剂的极为重要的非质子 极性溶剂；也是一种渗透性保护剂 ，能够降低细胞冰点，减轻自由基 对细胞损害，改变生物膜对电解质 、药物、毒物和代谢产物的通透性 。 研究表明，DMSO存在严重的毒性作用，与蛋白质 疏水集团发生作用，导致蛋白质变性。DMSO用的 时候要避免其挥发，要准备1%
8、-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤。材料：1、四膜虫培养液一种单细胞原生动物，主要产自淡水，一般 呈倒卵形或梨形，具有两个细胞核。可在10倍镜下轻 松地观察其细胞形态及运动等方面的变化。 2、各种试剂 1mol/L NaOH；1mol/L HCl；1%甲醛； 1%Triton X-100；1% SDS；1%次氯酸钠；1%巯基 乙醇；1% DMSO；0.25mol/L 蔗糖；0.15mol/L NaCl ；蒸馏水。 器材：载玻片、盖玻片、显微镜、牙签二、试剂和器材试剂：本实验涉及试剂较多，且大多为 无色透明液体。实验时请注意小离 心管表面的标签，以免搞错试剂！ 并请大家用
9、记号笔分别在离心管闭 上做好记号！三、实验操作（一）观察正常状态下的四膜虫 试剂：四膜虫培养液 1、在一干净载玻片上滴加四膜虫培养 液10l。不加盖玻片，在10倍镜下观察 四膜虫的形态和运动状态，然后加上盖 玻片用40倍镜观察，注意四膜虫纤毛和 内部的结构运动，特别是伸缩泡的运动 节奏，记录现象。 （二）各种试剂对四膜虫的影响 （以NaOH为例）1、取1mol/L NaOH的小离心管（标 记为A1）和3只空白1.5ml离心管，在 空白管外侧用记号笔标记好A0.1、 A0.01和A0.001，并用移液枪在空白管 中各加入900l蒸馏水。 2、从A1管中准确吸取100l液体，加 入A0.1管中，吹
10、打混匀。再从A0.1管中 准确吸取100l液体，加入A0.01管中。 重复操作，直到最后一管。操作过程中 不必更换枪头！A1A0.1A0.01A0.001100 l100 l100 l3、取两片干净载玻片，左侧标记为A1，右侧 标记为A0.1；另外取两片干净载玻片，左侧标 记为A0.01，右侧标记为A0.001。 4、用同一枪头，依次从浓度最低的A0.001开始 ，分别吸取50 l液体，滴加在载玻片上已标记出的相应位置上，不要涂开！ A1A0.1A0.01A0.0015、用装有四膜虫培养液的小塑料瓶从浓度最 低的A0.001开始，一次在每一50l的液滴上滴加 一滴四膜虫培养液（约2030l），
11、马上用牙签将其混匀，直到浓度最高的样，不必更换牙 签！ 6、混合了最后一个样后，立即开始计时，马 上将样品在10倍镜下观察，先从浓度高的开始，将各浓度依次观察，记录现象。每组两个同学各观察1张载玻片！A0.01A0.0017、如在观察浓度最高的样品时发现反应太快而无法观察仔细，可做如下处理：另取干净载玻片，先滴加50l浓度最高的试剂，在其近旁滴加一滴四膜虫培养液，注意勿使两液混 合。将载玻片放显微镜下，观察到四膜虫后 用牙签将两者混合，立即观察！50lA1液体四膜虫后面的试剂可如NaOH一样操作，分别标记如下：A1mol/L NaOH B1mol/L HCl C0.1% Triton X-10
12、0 D0.1 SDS E1% 次氯酸钠 F1% 巯基乙醇 G1% 甲醛 H0.25mol/L 蔗糖 I0.15mol/L NaCl J1% DMSO按表记录观察结果四、实验记录试剂稀释 度观察到的变化 细胞形态运动情 况其他时 间 NaOH (A)10.10.010.001四、注意事项 1、四膜虫为淡水性原生生物，可承受一定 的低渗压。实验时应选择培养约3天的四膜 虫培养液，一则细胞数目较多，二则细胞比 较新鲜。如培养时间过久，大部分细胞处于 衰老期，细胞运动不明显。 2、加入去垢剂后四膜虫细胞发生变化非常 快，需立即观察。非离子型去垢剂和离子型 去垢剂对细胞膜作用的效果有所不同，可进 行比较
13、。 3、四膜虫的细胞比较大，可在低倍镜下观 察其生理状态，但如没有经过固定染色，应 将光线适当调暗，以方便观察。 4、如要准确计时，最好准备秒表。 在实验报告中按自己的观察结果回答 下列问题： 1. 四膜虫更耐酸还是碱？酸和碱何者 对四膜虫的破坏大？ 2. 氧化剂和还原剂何者对四膜虫的影 响大？ 3. SDS与Triton X-100两种去垢剂何 者作用更强？ 4. 高渗溶液在稀释后对四膜虫的作用 是否如你所预料？ 5. DMSO在所给的浓度下对四膜虫的 作用如何？五、作业五、思考题1、能够理解渗透压、去垢剂对细胞形态功能 上发生的作用和机制，并能够准确地描述所 观察到的现象及给出合理的解释。 2为什么溶液中酸碱度可对活细胞产生严重 的影响？最后请同学们在实验结束后把桌面 整理好，使用过的离心管、盖玻片 丢到垃圾桶里，载玻片洗净回收， 登记好显微镜使用记录本，经助教检查后再离开!
