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1、SCGE 法检测 DNA 损伤SCGE 的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）SCGE 技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞 DNA 损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的 DNA 分子量很大，DNA 超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的 RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核 DNA 仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核 DNA 因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团
2、，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核 DNA 仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响 DNA 双螺旋大分子的连续性。只有当 DNA 双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH13)中，先是 DNA 双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核 DNA 向阳极迁移，形成拖尾。细胞核 DNA 受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的 DNA 量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定 D
3、NA 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞 DNA 损伤程度。1. 仪器及试剂冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。不含Ca 2+、Mg 2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA ）及低溶点琼脂糖（LMA） （0.6溶于PBS） ；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1 TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO） ） ；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13） ；0.4 M Tris-HCl（ PH=7.5） ； 无水乙醇；
4、20-30g/mL 溴化乙锭（ EB） 。2. 方法1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用 0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加 PBS(PH 7.4) 研磨,过 300 目筛子,收集细胞,悬浮于 PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6 个/ mL （血细胞计数板最中央每小格 0.5 个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率 90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理：1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min 离心 5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，
5、获得细胞悬液。a.枸椽酸钠抗凝:有2Na 3C6H5O7。和2Na 3C6H511H2O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度） ，与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素 152.5Iu.c.EDTA 盐经 1000C 烘干，抗凝作用不变，通常配成 15g/L 水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝 5ml 血液。EDTA 盐对红、白细胞形态影响很小.2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份:A 份 1ml； B 份 0.9ml。 B 份里再加0.1ml 5mmol 的
6、过氧化氢，混匀。全部冰浴 1 小时。完后检测细胞存活率(台盼蓝染色、镜检)(过氧化氢处理用于检测 DNA 交联)。3）应用细胞悬液制备：4 度下，1000r/min 离心 5 分钟。去上清，加 PBS(PH 7.4)。每份制作 2 片凝胶。3. 制胶将载玻片用砂纸(粒度No. 380)磨出痕迹, 以便凝胶附着. 将37C正常溶点0.6琼脂糖液（溶于不含Ca 2+、Mg 2+的PBS，需要沸水加热）75-100l铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片4凝固10分钟以上, 去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液85l(10l含1000 个细胞的PBS和75l 0.6%的低熔点琼脂糖(LMA)
7、 在37 混匀)铺展到载玻片上作为第二层, 4至少10分钟, 凝固后再铺展低溶点0.6琼脂糖100l作为第三层, 使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式.（注意：NMA 适宜浓度0. 5 %1 % ,过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。LMA 凝胶浓度直接关系到DNA 迁移长度 ,0. 6 % 较适宜。第3 层LMA 可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）4. 裂解4凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4预冷细胞裂解液（含2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris-HCl(
8、PH=10)，用前加1 TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO），裂解不少于1h。此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA 等,仅存留核骨架。5. 电泳裂解后将玻片晾干，并列置于水平电泳槽的阳极端，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面约2.5mm，静置20-60min 解链。之后接通电源，电泳条件25V，300mA，时间20-40分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)。（注意：电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。文献报道为1850 V ,200300 mA ,2
9、0 40 min 。我们采用25 V ,300 mA ,20min ,效果良好。电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定）6，染色电泳结束后，用 0.4 M Tris-HCl (PH7.5) 洗涤三次，每次 5 分钟，呈中性后，凉干玻片，(无水乙醇处理 30 分钟可增加荧光强度) 每片滴加 50l 20-30gml 的 EB 染色 1520min，然后用蒸馏水洗滴，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。24 小时内检测，时间过长将导致荧光褪色。（注意：可在染色后4 避光潮湿条件下保存,数日后观察。但我们通过实践得出为防止荧光衰减,尽快阅片较好。阅片过程中,由于淬灭效应
10、,荧光减弱很快,因此操作必须紧凑。结果可直接在荧光显微镜下分析,或先摄影,再进行照片分析。但摄影、相片冲洗条件等较难控制统一,因此应尽量直接分析）以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的 DNA 损伤。应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。6观察使用 100W 汞灯作为荧光光源，在荧光显微镜（激发波长为 549nm,发射波长为 590nm）下，损伤的细胞 DNA 呈现由圆形、致密红色核心（慧头）和朝向阳极的尾端 DNA 碎片（慧尾）构成的“慧星”。本实验选用 DNA 断裂分级和DNA 慧星尾长两种观察指标。DNA 断裂分级按慧星尾部占全部 DNA 量的比例判断。0 级：无断裂级损伤；
11、A 级：轻度断裂损伤，断裂损伤10%；B 级：中度断裂损伤，断裂损伤 10%-20%；C 级：重度断裂损伤，断裂损伤60% “慧星”,每片随机计数 50 个“慧星”，计算各级所占比例。DNA 慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度(格数)。每片随机测量 25 个“慧星”尾长,计算均数。7统计分析：应用 SPSS 软件分别对彗星尾长和断裂进行方差分析和卡平方检验。表一：DNA 断裂损伤分级编号0 A B C D表二：编号 尾长 头直径 下降率预期结果：污染越严重，随着 DNA 链受损程度越大, 出现慧尾的细胞数越多，慧星尾中的 DNA 含量及尾长也就增加。单细胞凝胶电泳技术在
12、军事毒理学中的应用作者：张慧丽 余卫 闫长会2003-9-2由 Ostling 和 Jonhanson 首先提出，后又经 Singh 和 Olive 建立和改进的单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis，简称 SCGE)技术，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验(Comet Assay)。它是一种测定和研究单个细胞 DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。该技术可用于体内、体外各种实验，目前已广泛地应用于各种有核细胞经受试物诱导的 DNA 损伤和修复的研究。在国外，SCGE 被用于遗传毒
13、理学、放射生物学、环境生物监测、药物筛选、肿瘤发病机理及诊断与治疗、衰老和细胞凋亡机制的研究等，正在形成一个新的研究领域，有关应用该技术的报告也是逐年增加1，2。然而，国内关于该技术的研究报告仅有几篇。本文就该技术的原理、操作程序和方法作一简介，并预测其在军事毒理学研究中将有广阔的应用前景。 1 SCGE 的原理SCGE 技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞 DNA 损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的 DNA 分子量很大，DNA 超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的 RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶
14、，继而扩散到裂解液中，唯独核 DNA 仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核 DNA 因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核 DNA 仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响 DNA 双螺旋大分子的连续性。只有当 DNA 双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH13)中，先是 DNA 双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核 DNA 向阳极迁移
15、，形成拖尾。细胞核 DNA 受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的 DNA 量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定 DNA 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞 DNA 损伤程度。2 SCGE 实验程序和方法至今，SCGE 技术在世界上许多实验室应用，操作上进行了许多改良，并不断地融进新技术，如荧光原位杂交彗星试验3等。但是，最常用的还是碱性SCGE 方法，其基本操作程序如下：2.1 处理因素 如今已有 70 多种处理因素，简要概括为：辐射因素(X 射线，60Co、 137Cs、125I 等发出的 射线，各种紫
16、外线，中子等)、各处氧化剂(H2O2、KMnO4、NaAsO4 等)、烃化剂( 顺泊、丝裂霉素、氮芥、 AzQ、BzQ 等)、抗癌药(Bleomycin、环磷酰胺等 )、诱变剂(MNNG、MCC 等)、农药(二氯胺基酚等)、溶剂 (苯、甲苯、二甲苯等)、重金属、环境因素(烟雾、CO 、高温、低温、粉尘等)、药物( 吗啡、咖啡因等)。处理方式( 体内或体外)及处理时间根据实验研究目的而定。2.2 制备细胞悬液 单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、中国仓鼠、狗、鱼、鸡等)和植物的组织或培养的细胞系。Mckelvey-Martin 和 Fairbairn 等人曾报道从活体组织分离的原代细胞近 20 种，近两年又有脱落的人颊粘膜细胞、人白血病K562 细胞、鱼的红细胞、植物种子细胞等，其中最常用的是人外周血淋巴细胞。经过培养的正常组织细胞或肿瘤组织细胞已有 20 余种，如 Hela 细胞、MeWo细胞、BEAs 细胞 NHBE 细胞等。根据不同组织细胞生长培养条件，选择合适的培养基
