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1、酶联免疫吸附试验 【目的要求】 通过操作本试验，掌握酶联免疫吸附试（ELISA）的基本原理与方 法。 了解本试验对实践生产的指导意义。 【实验原理】【实验材料】 （1）聚乙烯塑料板、酶联免疫吸附试验检测仪、微量移液器。 （2）包被液、洗涤液、底物稀释液、显色液、终止液、稳定液。 （3）兔抗鸡酶标抗体、抗原、待检鸡血清、阳性血清、阴性血清 。 【实验方法】 【结果判定】 凡检测血清P/N值，超过1.5判为阳性（P/N值是检测标本的吸收值 与一组阴性标本吸收值的比值）。如无检测仪，可用肉眼观察， 反应孔颜色变成棕黄色，比正常细胞、正常血清（阴性血清）对 照孔颜色（浅黄色）深者判为阳性。 【作业】
2、1.酶联免疫吸附试验为什么是一种较敏感的血清学方法？ 2.酶联免疫吸附试验操作时应注意哪些事项？如何判定结果？ AgAbAb2E包被：室温过夜，之后用洗涤 液洗6次，甩干加入待检样品：37静置20min ，之后洗涤液洗6次加入二抗： 37静置20min， 之后洗涤液洗6次加入显色液，室温作用30min， 加入终止液，读值禽病诊断新技术 【目的要求】了解免疫胶体金技术、PCR技术诊断方法的原理和操作方法 。了解免疫胶体金技术、PCR技术对禽病诊断的意义。 一、免疫胶体金技术 原理 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标 记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样 本加到试纸条一
3、段的样本垫上后，通过毛细作用向前移动 ，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，在移动到 固定的抗原或抗体的区域时，待检物与之发生特异性结合 而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果 。PCR诊断技术PCR技术和以上诊断技术的不同之处：不是建立在免疫学基础之上，而是 直接针对病原的一项诊断技术，能够克服动物已经感染病原，但是体内还 未产生血清或血清浓度过低，导致使用免疫血清学诊断技术无法作出正确 的诊断。因为需要特殊的仪器设备，该方法主要用于科研方面。 PCR设计思路和操作方法：根据待建病毒已发表的序列，选取该病毒最保 守的基因片段，设计其扩增引物；提取感染组织的DNA或RNA，进行
4、PCR扩增；取PCR扩增产物进行凝胶电泳，然后将电泳后 的凝胶放在紫外灯下观察，若出现目的片段，即可视为阳性。更准确的结 果判定可将PCR扩增产物测序，该图为PCR产物凝胶电泳产物：由于DNA带有电荷，将其放 入电泳池内，会向与其电荷相反的方向移动，而且其移动 速度与其核苷酸的含量呈反比，根据这一特性，可以判断 出PCR产物的大小。aatgcttgataggatctacgttcgatacgtcaggaattttacgaactatcctagatgcaagctatgcagtccttaa设计两条引物，长度在1220个碱基之间，然后 通过聚合酶的作用，使其在有模板的情况下，经过若 干次循环，产生与模板一样的DNA双链，之后可通过凝胶 电泳技术将该片段分离出来，如扩增出的片段与预期大小 一致可初步确诊，进一步确诊可通过测定扩增片段的序列 。
