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1、酶联免疫吸附试验 【目的要求】 通过操作本试验,掌握酶联免疫吸附试(ELISA)的基本原理与方 法。 了解本试验对实践生产的指导意义。 【实验原理】【实验材料】 (1)聚乙烯塑料板、酶联免疫吸附试验检测仪、微量移液器。 (2)包被液、洗涤液、底物稀释液、显色液、终止液、稳定液。 (3)兔抗鸡酶标抗体、抗原、待检鸡血清、阳性血清、阴性血清 。 【实验方法】 【结果判定】 凡检测血清P/N值,超过1.5判为阳性(P/N值是检测标本的吸收值 与一组阴性标本吸收值的比值)。如无检测仪,可用肉眼观察, 反应孔颜色变成棕黄色,比正常细胞、正常血清(阴性血清)对 照孔颜色(浅黄色)深者判为阳性。 【作业】
2、1.酶联免疫吸附试验为什么是一种较敏感的血清学方法? 2.酶联免疫吸附试验操作时应注意哪些事项?如何判定结果? AgAbAb2E包被:室温过夜,之后用洗涤 液洗6次,甩干加入待检样品:37静置20min ,之后洗涤液洗6次加入二抗: 37静置20min, 之后洗涤液洗6次加入显色液,室温作用30min, 加入终止液,读值禽病诊断新技术 【目的要求】了解免疫胶体金技术、PCR技术诊断方法的原理和操作方法 。了解免疫胶体金技术、PCR技术对禽病诊断的意义。 一、免疫胶体金技术 原理 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上,胶体金标 记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上,当待检样 本加到试纸条一
3、段的样本垫上后,通过毛细作用向前移动 ,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,在移动到 固定的抗原或抗体的区域时,待检物与之发生特异性结合 而被截留,聚集在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果 。PCR诊断技术PCR技术和以上诊断技术的不同之处:不是建立在免疫学基础之上,而是 直接针对病原的一项诊断技术,能够克服动物已经感染病原,但是体内还 未产生血清或血清浓度过低,导致使用免疫血清学诊断技术无法作出正确 的诊断。因为需要特殊的仪器设备,该方法主要用于科研方面。 PCR设计思路和操作方法:根据待建病毒已发表的序列,选取该病毒最保 守的基因片段,设计其扩增引物;提取感染组织的DNA或RNA,进行
4、PCR扩增;取PCR扩增产物进行凝胶电泳,然后将电泳后 的凝胶放在紫外灯下观察,若出现目的片段,即可视为阳性。更准确的结 果判定可将PCR扩增产物测序,该图为PCR产物凝胶电泳产物:由于DNA带有电荷,将其放 入电泳池内,会向与其电荷相反的方向移动,而且其移动 速度与其核苷酸的含量呈反比,根据这一特性,可以判断 出PCR产物的大小。aatgcttgataggatctacgttcgatacgtcaggaattttacgaactatcctagatgcaagctatgcagtccttaa设计两条引物,长度在1220个碱基之间,然后 通过聚合酶的作用,使其在有模板的情况下,经过若 干次循环,产生与模板一样的DNA双链,之后可通过凝胶 电泳技术将该片段分离出来,如扩增出的片段与预期大小 一致可初步确诊,进一步确诊可通过测定扩增片段的序列 。