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1、白孔雀开屏白孔雀开屏1白孔雀开屏白孔雀开屏2细胞生物学技术及其进展分析测试中心分析测试中心-张琳张琳3内容提纲内容提纲 细胞分选技术细胞分选技术-流式细胞术流式细胞术 原子力显微镜原子力显微镜概概述述4流式细胞术流式细胞术Flow Flow cytometrycytometry , FCM , FCMFCMFCM5内容提纲内容提纲 细胞分选技术细胞分选技术流式细胞术概述流式细胞术概述 流式细胞仪的原理和构造流式细胞仪的原理和构造 流式细胞仪的测试原理流式细胞仪的测试原理 流式细胞仪使用步骤流式细胞仪使用步骤 流式细胞仪的应用范围流式细胞仪的应用范围FCMFCM6一、细胞的分选技术一、细胞的分选
2、技术 离心技术离心技术 电泳技术电泳技术 流式细胞术流式细胞术 FCMFCM7离心技术离心技术 离心技术离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因素的不同，而使物质分离的技术。随着力等因素的不同，而使物质分离的技术。随着生物化学、分子生物学和生物工程的发展，离生物化学、分子生物学和生物工程的发展，离心分离技术已在科研、生产中广泛应用。特别心分离技术已在科研、生产中广泛应用。特别是超速离心技术已经成为分离、纯化和鉴别各是超速离心技术已经成为分离、纯化和鉴别各种生物大分子的重要手段之
3、一。种生物大分子的重要手段之一。 FCMFCM8离心机的分类及用途离心机的分类及用途 低速离心机低速离心机：转速为8000rpm以下；相对离心力为10000g以下；主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物，也用于粗结晶的较大颗粒的分离。 高速离心机高速离心机：转速为1000025000rpm；相对离心力为10000100000g;主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机设有冷冻装置，所以叫做冷冻离心机。 超速离心机超速离心机：转速为2500080000rpm；最大相对离心力为500000g;为了防止温度升高和
4、降低空气阻力和磨擦，超速离心机设有冷冻和真空系统。主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离、纯化。FCMFCM9电泳技术电泳技术 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 此外由于不同类型的细胞成分在电场中的泳动速度不同，可用来分离不同种类的细胞成分。10电泳技术的分类电泳技术的分类 自由电泳自由电泳（无支持体）：Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度
5、电泳。 区带电泳区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 11流式细胞术流式细胞术 （Flow Flow cytometrycytometry , FCM , FCM ）流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术分析技术和分选技术。其特点特点是：测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞； 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力激光技术、计算机技术、流体力学
6、、细胞化学、图像技术学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。FCMFCM12流式细胞术是对流式细胞术是对单个细胞单个细胞进行快速定量分析与分选的进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光散射光和荧光，经，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根
7、据这些性质分选高纯度的细胞亚群，统计结果，并可根据这些性质分选高纯度的细胞亚群，分离纯度可达分离纯度可达99%99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（仪器称为流式细胞计（flow flow cytometercytometer）。）。FCMFCM13流式细胞术是一种能快速定量测量悬液中单个细流式细胞术是一种能快速定量测量悬液中单个细胞所发出的胞所发出的散射光和荧光散射光和荧光的技术。一般每秒可测的技术。一般每秒可测达达50005000个细胞，且具有高度的重复性。它能对特个细胞，且具有高度的重复性。它能对特殊分子定量测量，精确统计，能进行多参数相互殊
8、分子定量测量，精确统计，能进行多参数相互的相关数据分析。鉴定细胞亚型，具有较高的灵的相关数据分析。鉴定细胞亚型，具有较高的灵敏度及测定速度。目前已广泛应用于免疫学、生敏度及测定速度。目前已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。究和临床常规工作。FCMFCM14 流式细胞术流式细胞术(Flow (Flow CytometryCytometry):):利用流式细胞利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达数、快速（每秒可达1000-10000100
9、0-10000个）的个）的定量分定量分析和分选析和分选（纯度可达（纯度可达99%99%以上）以上）的技术的技术。 流式细胞仪流式细胞仪(Flow (Flow CytometerCytometer):):是集光电子物理是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。术为一体的高科技细胞分析仪。FCMFCM15流式细胞仪流式细胞仪(FCM)(FCM)分类分类 台式机台式机: :仪器的光路调节系统固定，自动仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学，但一般没有化程度高，操作简便，易学，但一般没有细胞分选功能。细胞分选
10、功能。 大型机大型机: :可快速将感兴趣的细胞分选出来可快速将感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养皿内，同时可选配多种波长和特定的培养皿内，同时可选配多种波长和类型的激光器。类型的激光器。FCMFCM16台式机台式机大型机大型机FCMFCM17Coulter Epics Elite Coulter Epics Elite FCMFCM18二、流式细胞仪的原理和构造二、流式细胞仪的原理和构造流式细胞术的原理流式细胞术的原理：让荧光染色荧光染色的细胞的细胞在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50-100um的小孔并排列成单行，每个细
11、胞依次而且恒速通过激光束激光束的照射区，细胞受激光照射后产生散射光和荧光散射光和荧光。通过检测散射光可知细通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞胞的体积，检测荧光可知细胞DNADNA或或RNARNA的含量的含量。根据所规定的参量可把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，以便进一步的研究分析。 FCMFCM19流式细胞术的原理流式细胞术的原理细胞的分选是通过流束形成含有 细胞的带电液滴而实现的。在流 动室的喷嘴上装备有一个超声振 荡压晶体片，这个振荡装置使自 喷嘴射出的液束破碎成千万个小 滴，流动的细胞就被分散在这些 小水滴中。这时给流束一个电脉 冲信号，使小水滴就全部带上电 荷。当带有不
12、同电荷的细胞液流 经一对带正、负几千伏恒定静电 电场的偏转板时，带电的小水滴 就根据自身所带的电荷性质产生 偏转，落入各自的收集容器中， 不带电荷的水滴就进入中间的废 液容器中，从而实现了细胞的分 选 FCMFCM20流式细胞仪分选细胞示意图流式细胞仪分选细胞示意图 激光光源激光光源：可发出合适波长的光。 流室流室(flow (flow chamber):chamber):生物颗粒在 此与鞘液(sheath fluid)相混。鞘液 包裹着细胞的液滴经喷嘴(tip)流出 ，当液滴下流至适当位置，受激光照 射可发射出不同的光讯号。 讯号接受器讯号接受器(detector)(detector)由光学
13、透 镜装置和光电倍增管组成，接收放大 各种光讯号，并把它们转变成电脉冲 讯号。 讯号分析部件讯号分析部件为微型电子计算机 装置，对讯号作出分析。FCMFCM21流式细胞仪工作简图流式细胞仪工作简图FCMFCM22待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的 流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差压力差 异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个 经过激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的 标上荧光染料，那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受 激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色 片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送 到不
14、同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数 字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染 料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料 ，我们可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征； 如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的 分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。23在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。用流式细胞计分选细胞用流式细胞计分选细
15、胞 FCMFCM24流式细胞仪结构流式细胞仪结构 流动室和液流系统流动室和液流系统 激光源和光学系统激光源和光学系统 光电管和检测系统光电管和检测系统 计算机和分析系统计算机和分析系统FCMFCM25流式细胞仪的配置流式细胞仪的配置流式细胞仪系统框图流式细胞仪系统框图26 光源系统光源系统: :提供合适的激发光光束，主要包括：激光提供合适的激发光光束，主要包括：激光器、分色反色镜、光束成型器。器、分色反色镜、光束成型器。 激光器激光器: :提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。紫外、细胞微弱荧光快速分析的理想光源。紫外、48
16、8nm488nm、633nm633nm 分色反色镜分色反色镜: :紫外：长通分色反色镜紫外：长通分色反色镜488nm 488nm、633nm633nm：短通分色反色镜：短通分色反色镜 光束成形器光束成形器: :两个十字交叉放置的圆柱透镜，将圆形两个十字交叉放置的圆柱透镜，将圆形激光束聚焦成椭圆形光束。激光束聚焦成椭圆形光束。27 光变换系统光变换系统: :光变换在细胞流过喷嘴时完成。其作用其作用：1. 将部分激光变换成反映细胞属性的前向散射激光前向散射激光和侧向散侧向散射激光射激光。2. 将部分激光转换成与细胞内荧光染料浓度成 正比的荧光荧光。细胞通过激光照射区时 ，受激光激发，产生代表细胞内不 同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散色光和荧
