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1、常见免疫方法分析及三项（丙 肝、艾滋、梅毒）检测总述第一节 免疫学简介 第二节 免疫学检测方法 第三节 艾滋病及检测 第四节 丙型肝炎及检测 第五节 梅毒及检测一、免疫（Immune）的定义n免疫的最初概念：免除瘟疫n免疫的传统概念：抗感染免疫n现代免疫的概念：是机体识别“自身”与“非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生理功能。第一节 免疫的基本概念浆细胞粒细胞单核细胞巨噬细胞T细胞B细胞免疫球蛋白补体细胞因子二、免 疫 的 功 能免疫功能是免疫系统在识别和清除“非己”抗原的过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括：1.免疫防御（Immunologic de
2、fence)：是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反应，过弱则表现为免疫缺陷。2.免疫自稳(immunologic homeostasis)：是免疫系统维持机体内环境相对稳定的生理功能 。正常：可及时清除体内损伤、衰老、变性的血 细胞和抗原抗体复合物，而对自身成 份保持免疫耐受；异常：可发生生理功能紊乱、自身免疫病等。3.免疫监视(immunologic surveillance)：是机体免疫系统识别、清除体内突变、畸变细胞以及被病毒感染细胞的生理性保护作用。丧失：机体突变细胞失控，可能导致肿瘤发生或出现病毒的持续感染。第二节 免疫学检测技术免疫检
3、验可分为两部分：一部分为利用免疫检测原理与技术检 测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细 胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质；另一部分是利用免疫检测原理与技术 检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微 量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合免疫球蛋白凝集反应目前常用的目前常用的ELISAELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验）化学
4、发光免疫分析化学发光免疫分析待测样品待测样品标记抗体或抗原标记抗体或抗原洗涤去除未结合的反应物洗涤去除未结合的反应物发光底物发光底物 仪器检测仪器检测包被抗体或抗原的反应管包被抗体或抗原的反应管反应反应30-6030-60分钟分钟反应反应0-50-5分钟分钟固相 抗原待测 抗体金标记 抗原针对金标 记抗原的 抗体快速检测（层析法）原理T CT C阳性阴性放射免疫技术 化学发光免疫技术荧光免疫技术 流式细胞免疫技术酶联免疫技术 免疫印迹技术速率散射免疫技术 单克隆抗体技术电化学发光免疫技术免疫检验涉及的主要技术第三节 艾滋病1.HIV病毒体呈球形，直径 约100120nm。 2.电镜下成熟的HI
5、V-1呈现 一致密的圆柱状核心和一个 病毒包膜。 3.病毒核心由病毒RNA、核 心结构蛋白和病毒复制所必 须的酶类组成。 4.HIV的RNA为两条相同拷 贝（完全同源）的正股RNA 链。一. HIV病原学基础病毒分类与分型：vHIV分为HIV-1和HIV-2二个型别。vHIV-1 分M组（主要亚型组）、O亚型组（外亚型） 和N亚型组。vM组又分为A、B、C、D、F1、F2、G、H、J、K共10 个非重组亚型，另外还有14个流行重组亚型（ circulating recombinant form,CRFs） ，包括 CRF01- CRF14。vHIV-2型至少有A-G7个亚型。（一）形态与结构v
6、HIV基因组:两条正股RNA链,在5端通过部分碱基互 补配对而成双聚体。v病毒基因全长约9.7kb，含有gag、pol、env3个结构 基因和6个调节基因，分别称为tat(反式激活因子)、 rev(毒粒蛋白表达调节子)、nef(负调控因子)、vpr(病 毒r蛋白)、vpu(病毒u蛋白，仅存在于HIV-1，在HIV- 2为vpx)和vif(毒粒感染性因子)。v由于HIV基因结构复杂而被称为复杂逆转录病毒。基因结构HIV-1的基因结构.HIV的结构蛋白vgag基因：先编码一个55KD的前体蛋白（P55），在蛋白 酶作用下裂解形成内膜蛋白（P17）衣壳蛋白（P24）和 P15蛋白。P15蛋白再进一步
7、裂解成与病毒结合的核壳蛋白P9和P7 。venv基因：编码包膜糖蛋白，先编码一个88KD的蛋白， 经糖基化后分子量增至160KD，即包膜糖蛋白的前体 gp160。在蛋白酶作用下，切割成gp120 和gp41。vpol基因：编码酶蛋白，包括逆转录酶（p66/p51）、蛋 白水解酶（p10）和整合酶(p32)，与病毒复制有密切的 关系。gp120暴露于病毒包膜之外，称外膜糖蛋白，感 染细胞时是病毒与宿主细胞表面的CD4受体结合 的部位。 gp41是跨膜糖蛋白，具有介导病毒包膜与宿主 细胞膜融合的作用。 当gp120与受体结合后即与gp41分离，暴露出 gp41，在辅助受体协同作用下通过膜融合使病
8、毒核心导入细胞。（二）病毒在体内的动态分期v病毒进入体内在2天内到达局部淋巴结，5天 内进入血液循环。v其结果是导致全身性播散，到达脑部和淋巴 组织。1、体内播散期v从暴露于HIV到出现急性症状的时间一般是2- 4周（1个月），少数病例可长达10个月。v在急性感染的数天内，淋巴结内被激活的淋 巴细胞中出现高水平的病毒复制，在很短的 几天内出现P24抗原血症和高滴度病毒血症， 病毒快速高水平复制，血浆中可检出107 /ml 个病毒RNA分子。CD8+细胞数上升，伴有短 暂的CD4+细胞计数下降。2、HIV感染急性期v特异性体液免疫应答出现后，血浆中HIV RNA 的滴度下降到病毒载量定点（set
9、 point）水 平，急性HIV感染的症状消失. v病毒载量定点水平和预后有很大关系。早期治 疗的目标之一是重新设定定点水平，使其保持 较低水平。v急性期HIV传播的效率最高，56-92% 的HIV感 染是由处在这个时期的HIV感染者传播的。v从HIV感染到产生抗体（或血清抗体阳转）称 为“窗口期”，一般为2-3 月，最长6个月。v病人无临床症状，体检时无异常，少数可查到 “持续性全身性淋巴腺病”（PGL），定义为肿 大的淋巴结至少发生在两处且不是腹股沟淋巴 结。v由于细胞外的病毒被滤泡树突状细胞（FDC） 扑捉而进入生发中心，细胞内的病毒大部分处 于潜伏状态，所以淋巴结中病毒浓度很高。v淋巴
10、组织是病毒的主要藏身处，外周血中的病 毒载量相对不高。随着疾病的进程，淋巴结结 构被破坏，更多的病毒被释放。3、无症状感染期艾滋病前期症状包括鹅口疮、口腔毛状 黏膜白斑病、发热、体重减轻等，但还不是 艾滋病的典型症状。4 4、艾滋病前期、艾滋病前期5、艾滋病期当患者出现典型症状(ARC)时，CD4+ 细胞计数通常降至200/ul以下，血和淋巴结 中的HIV又上升到相当高的水平，同时细胞 免疫水平降低。v指CD4计数 2个月2 重组或多肽 间接3-4 周3 重组+多肽夹心4-7 天4抗原+抗体夹心抗原 5pgHIV抗体筛查实验流程图样本阳性反应一阴一阳阴性反应筛查检测均阳性反应重复检测均阴性反应
11、送确认实验室进行确认阴性报告筛查试剂原有试剂加另外一种筛查试剂筛查检测要点筛查检测要点- - 严格按照说明书操作严格按照说明书操作-严格遵守实验室操作规程严格遵守实验室操作规程- - 严格防止交叉污染，吸管、枪头单独使严格防止交叉污染，吸管、枪头单独使 用用- - 严格执行实验室生物安全制度严格执行实验室生物安全制度筛查结果及复检筛查结果及复检- - 筛查（筛查（- -） 出具出具“HIVHIV抗体非反应性抗体非反应性”报告报告筛查（筛查（+ +） 出具出具“HIVHIV抗体待复查抗体待复查”，不能出阳性报告不能出阳性报告 - - 复检：原有试剂另外一种不同原理或不同厂家试剂复检：原有试剂另外
12、一种不同原理或不同厂家试剂 （进口试剂：生物酶里埃（进口试剂：生物酶里埃（AKZOAKZO），可只用），可只用 原试剂复检）原试剂复检） 两种均阴性：报告两种均阴性：报告“HIVHIV抗体阴性抗体阴性” 一阴一阳或两种均阳性：出具一阴一阳或两种均阳性：出具“HIVHIV抗体待复查抗体待复查”，送确，送确 证实验室。证实验室。 - - 复检可在筛查中心实验室；也可在本实验室复检可在筛查中心实验室；也可在本实验室（二）（二） HIVHIV抗体检测：确认抗体检测：确认免疫印迹实验（免疫印迹实验（Western BlotWestern Blot）的原理）的原理HIV抗体确认实验检测程序筛查阳性样本免疫
13、印迹法1/2混合型阴性反应HIV1阳性反应可疑反应阴性报告HIV1阳性报告每三个月随访一次，共2次出现HIV2指示带阳性反应阴性反应HIV2鉴定、报告可疑反应阴性报告免疫印迹法HIV2型结果判断（一）vHIV-1阳性v技术规范：至少有2条env带：（ gp41+gp160）/（gp41+gp120）至少有1个env（gp41、gp160、gp120）p24v试剂盒提供的阳性判定标准结果判断（二）vHIV抗体阴性（-）：无HIV抗体特异带出现， 或仅有p17。 vHIV抗体不确定（）：出现HIV特异性抗体带 ，但带型不足以确认阳性者。图2 11例窗口期感染者样本的WB条带带型。造成WB假阳性或不
14、确定的原因v1. 18个月以内的抗体阳性婴幼儿 v2. HIV感染急性期 v3. 晚期AIDS病人v4. HIV疫苗接种 v5. 自身免疫病 v6. 肾衰竭和血透析 v7. 遗传性胰腺囊肿 v8. 多次怀孕或输血 v9. 肝病 v10. 注射用药 v11. 乙肝、狂犬等疫苗注射12. 其他人类逆转录病毒13. 线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体14. 高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）15. 正常人类核糖核蛋白假阴性结果v指EIA+WB的假阴性v原因急性感染后的抗体迟反应不同HIV毒株型发病晚期抗体消失窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关HIV亚型实验室操作v有研究证明：即使在无高
15、危行为的普通人 群中， WB不确定率10-15%，甚至高达32 . P24条带最常见。v统计学分析表明：在S/CO比值6时，抗 体筛查实验阳性样本中，确认“可疑”和“阴 性”的两组样本之间无显著性差异。参考文献：黑发欣，张启云，孙伟东，等. HIV抗体筛查实验阳性-确认实验“可疑”和“阴性”样本的对比分析. 中国艾滋病性病, 2006, 12 (1) : 4-6. 不确定标本的处理v按照全国艾滋病检测技术规范（2004年版）的 要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复 检1次，连续2次，共6个月。v其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断 为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗
16、体阳性 判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗 口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月） ，只占 很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的 敏感性而出现条带。参考文献：黑发欣, 张启云，孙伟东，等. 病毒载量检测有助于排除人免 疫缺陷病毒抗体可疑结果中的非感染者. 中华预防医学杂志，2008，42（ 1）：4346. 18个月内HIV抗体呈阳性的婴幼儿，因可 能携带母亲的抗体，不能确定是否感染，应于出 生后18个月复查。不可轻易放弃婴幼儿的生命！ 第四节 丙型肝炎HCV的生物学性状v 4060nm球形v有包膜v+ssRNAHCV的基因结构： +ss RNA、9.5 kb，有9个基因区组成HCV的基因型有6种： 型：欧
