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1、第六章 蛋白质分子的定向进化蛋白质分子定向进化的原理蛋白质分子定向进化的策略蛋白质分子定向进化的应用对蛋白质分子的改造主要包括2个方面：蛋白质分子的合理设计:化学修饰， 定点突变蛋白质分子的非合理设计：定向进化一、蛋白质分子定向进化的原理所谓蛋白质分子的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计， 它不需事先了解蛋白质分子的空间结构和催 化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟 自然进化机制(随机突变、重组和自然选择) ，在体外改造蛋白质基因，并定向选择出所 需性质的突变蛋白质分子。理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定 向进化的基本先决条件。体外
2、定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合 理设计所不能解决的问题，为蛋白质分子的 结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且在 工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力 。定向进化 = 随机突变 + 选择前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某 一方向的进化而排除其他方向突变的作用， 整个进化过程完全是在人为控制下进行的。二、蛋白质分子定向进化的策略定向进化是由一个靶基因或一群相关的 家族基因起始创建分子多样性(突变和/或 重组)文库，然后对该多样性文库的基因 产物进行筛选，那些编码改进功能产物的 基因被利用来继续下一轮进化；重复这个 过程
3、直到达到目标。Directed evolution1、突变文库的建立易错PCR(Error Prone PCR)采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调 整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离子 ，改变体系中四种dNTP的浓度等，改变Taq酶的 突变频率，从而向目的基因中引入随机突变， 构建突变体库并从中选择或筛选所需要的突变 体。连续易错PCR是将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地 进行随机诱变。 DNA改组 (DNA shuffling)DNA改组是对一组同源基因进行体外随机重组 的特殊PCR技术，又称为基因洗牌术。先采用DNaseI消化不同来源的
4、的同源DNA，接 着将这些小片断进行无引物的PCR扩增，在此过 程中，随机片断之间互为模板和引物进行扩增 ，直到获得全长基因，形成突变文库。通过筛 选程序获得较理想的突变基因样本，作为下一 轮DNA改组的模板，重复直至获得性状满意的突 变基因。1. DNaseI产生随机片段； 2. 随机片段变性； 3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 体外随机重组法(RPR)体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模 板，配合一套随机序列引物，先产生大量互 补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱
5、基的 错配和 错误引发，这些短DNA片断中也会有 少量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互 为引物，合成出较长的片断，最终组装成完 整的基因长度，形成基因多样性文库。交错延伸法(StEP)交错延伸(staggered extension process, StEP)是 一种简化的DNA改组技术，它不是由短片段组 装全长基因，而是在PCR反应中，将含不同点 突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复 性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的 片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继 续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重 组，如此重复直至获得全长基因片段，结构产 生相间的含不同模板序列的新生D
6、NA分子。过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)渐增切割法产生杂和酶 Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE用核酸外切酶III分别消化两个非高度同源的靶基因，控制切割速度不大于10bp/min，每隔 很短时间连续取样，迅速终止样品反应，以获 得一组一次有几个甚至一个bp缺失的片断，然 后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生杂 和基因文库，表达该文库，通过酶活测定筛选 出理想的重组杂和基因。不依赖于DNA序列 同源性的随机重 组文库的构建同源序列非依赖性蛋白质重组（ sequence homology indepen
7、dent protein recombination, SHIPRE）将2个靶基因串联在同一载体上；PCR将硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物 中；用核酸外切酶III处理产生不同截短程 度的DNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基 因长度相似的随机片断，与表达载体连接 重组，转化受体细胞，形成表达型杂和蛋 白文库。 表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活 性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观 察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。 高通量筛选蛋白质突变体库的方法 ：如表面展示技术。2、突变文库的筛选噬菌体表面展示技术 Phag
8、e display techniques将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白 融合，伸展在噬菌体表面，可用来直接检 测表达产物的某些活性，从而实现基因型 和表型的转换，提供了高效率的筛选系统 ，广泛应用于基础和应用研究。基于三个原则：(1)在p和p衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的 融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响噬菌体的 生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相 应的抗体或受体所识别(2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘 洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选 出目的噬菌体(3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编
9、码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌 体的单链DNA测序推导出来，实现了基因型和表型的 转换 在蛋白质工程中的应用：将通过易错PCR、DNA改组等方法产生蛋白质或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面，通过 亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆 ，其一级结构可以从DNA的序列中推导出来， 可用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子 、新的酶抑制剂、转录因子的DNA结合新位点 、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学 活性的蛋白质等。核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分 子并进行选择与进化的技术。基本原理是通过PCR扩 增目的基因的DNA文库，同时加入启动子、核糖体结 合位点等，并置
10、于具有转录/翻译耦联的无细胞翻译 系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表 面，形成mRNA-蛋白质-核糖体三元复合体，最后利用 常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从 三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用 RT-PCR扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选 出高亲和力的目标分子。核糖体展示 Ribosomal Display, RD核糖体展示mRNA展示技术在mRNA的3末端连入一个嘌呤霉素标记的DNA linker片段,体外翻译时核糖 体会停在DNA linker与RNA之间的连接处, 嘌呤霉素进入核糖体A位点,并在肽酰转移 酶的作用下与天然多肽偶联。多肽-嘌呤
11、霉素-mRNA复合物与核糖体解离后,直接用 于亲和性筛选。核糖体展示技术与mRNA-多肽融合技术基本原理类似,只是后者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以 共价键的形式联系起来,从而避免了核糖体展示中 因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够 稳定的问题;另外mRNA-核糖体-多肽三元复合物中 的核糖体由于分子量较大可能会影响靶标蛋白的 筛选,导致高亲和力靶标分子的丢失,而mRNA-融合 技术避免了此类问题,更适合于严谨条件下(如高 温) 靶标分子的筛选。与噬菌体展示技术相比较，核糖体和mRNA展示技术不需要将DNA库转化到微生物中 ，因此，库容量的大小不受转化效率的限制 ，库容量比噬菌体肽库高
12、几个数量级。但是 ，核糖体展示和mRNA多肽融合技术都需要绝 大多数核糖体能将蛋白质翻译完全，以使其 能够正确折叠,这是筛选成功的关键之一。 细菌表面展示细菌表面展示技术是利用基因工程手 段将某一蛋白质或短肽段(靶蛋白)与细菌 外膜蛋白(载体蛋白)以融合蛋白的形式呈 现在细胞表面。外源蛋白与载体蛋白序列融合方式：C端融合，如脂蛋白-外膜蛋白A(Lpp-OmpA)系统 ，其OmpA的N端锚定在外膜；N端融合，如免疫球蛋白A蛋白酶家族中的一些成 员含有自动转运结构，其C端锚定在细胞外膜，适 于N端融合；夹心融合，如麦芽糖孔蛋白(Lamb)本身具有信 号肽序列及锚定于外膜的序列，在其内部合适位 点插
13、入外源蛋白，可实现细胞表面展示。OmpA是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一, 由325个氨 基酸残基组成，通过折叠跨膜8次,形成4个朝向膜外 的loop,在L2、L3、L4中插入外源基因都能获得表面表 达；IgA蛋白酶是致病性革兰氏阴性菌淋病奈瑟球菌的一种 分泌性酶,其分泌机制需要C末端的参与，N端含有特异 性的信号肽辅助其穿越内膜,C末端能整合在细菌外膜 上,中间部分为IgA蛋白酶的功能区，将外源基因取代 该区域可实现表面呈现；LamB是革兰氏阴性菌外膜蛋白Porin家族成员，其三维 结构显示Loop9(第375-405位氨基酸)是暴露的最大的 环，适于外源蛋白插入。革兰氏阳性菌表面展示系统葡
14、萄球菌蛋白A（SpA）由信号肽、IgG结合 区和C末端的表面结合区组成。葡萄球菌表 面呈现系统是利用SpA的C末端锚定区,用外 源蛋白取代IgG结合区片段，基因以质粒形 式存在于宿主细胞内，融合蛋白表达并呈 现在细菌表面。Pro- and eukaryotic surface display systems 细菌细胞表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪 (Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)或 流式细胞筛选仪(Flow cytometry)是非常有效的高 通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克 隆的功能特性。这种技术是当前惟一能够定量检测 单
15、细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。由于 在基因和它编码的蛋白质以及目的功能之间建立了 一个直接连接，大容量蛋白质突变体库的筛选被大 大简化。流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有明 显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参 数并且对每个观察到的克隆进行记录。 流式细胞术利用流式细胞仪对处在快速、直线、流 动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量 分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术 。 流式细胞仪集激光 技术、电子物理技 术、光电测量技术 计算机技术、细胞 荧光化学技术、单 克隆抗体技术为一 体的一种新型高科 技仪器。酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达 异源蛋白质的真
16、核展示系统，即把异源靶蛋白基因 序列与特定的载体基因序列(又叫定位序列)融合后 导入宿主细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面 的机制使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面。与噬 菌体和细菌细胞表面展示技术相比，酵母细胞表面 展示表达系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠和 与哺乳动物类似的分泌机制的优势。酵母表面展示将蛋白分子编码序列与-凝集素端(个 氨基酸残基，含有锚定信号序列)编码序列连接后 插入载体信号肽下游分泌表达，信号肽引导嵌合 分子向细胞外分泌，而凝集素则锚定在酵母细胞 壁中，从而将酶分子展示表达。a-凝集素由两对二硫键连接的ga1基因编码的核心亚基(个氨基酸残基)和ga2基因 编码的小结合亚基(个氨基酸残基)组成。a 凝集素的分泌蛋白AGA2通过两对二硫键与核心蛋 白GA1连接。目的蛋白与结合亚基GA2的C末 端融合。GA2融合蛋白和GA1在分泌途径中结 合，并被转运到细胞表面后与细胞壁共价结合。酵母展示系统应该满足以下几个条件：首先，表 达偏差应该是最小的，以便DNA库的多样性可代表正确 折叠蛋白质的多样性；
