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1、药品研究及生产过程中有关物 质的控制方法和要求上海药检所化学室 谢沐风1 有关物质的来源 原料药合成过程中带入; 制剂过程中产生; 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。 控制的必要性2* 有关物质的测定方法仪器角度： 高效液相色谱法（HPLC法）、 薄层色谱法（TLC法）、 紫外分光光度法（UV法）、 气相色谱法（GC法）、 毛细管电泳色谱法（CE）等试验角度： 对照品法 自身（稀释）对照法 归一化法3* 有关物质的计算方法 杂质对照品法 加响应因子（即重量校正因子）计算 的自身对照法、 不加响应因子计算的自身对照法 根据不同杂质采用不同方法等。* 有关物质的计算方法定量检测和限度检测4高效液相
2、色谱法（HPLC法）1 .色谱条件的确定（即专属性试验）专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各杂质均可与被分析物分离。配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液，来确证色谱条件的适用性。5专属性试验验证图谱62 . 检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。
3、 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。 目前国外有关该项研究的进展73. 供试品溶液浓度的确定（灵敏度试验最低检出量的测定） 供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定 是依据最低检出量和最大进样量来进行的。 最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义 确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓 度的多少而言。其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。 最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被 分析物不拖尾的浓度为准。83. 供试品溶液浓度的确定 设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达到对照溶液浓度的1/101/50（即
4、相当于供试品溶液浓度的0.1%0.02%）。也就是说供试品溶液的浓度至少是最低检出量的1000倍 20000 倍，又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。93. 供试品溶液浓度的确定 举例说明：进样量为20l，主成分的最低检出量为1g/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml 20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。 拖尾情况也可通过流速进行适当调节103. 供试品溶液浓度的确定11
5、4. 加样回收试验（即准确性试验）准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。125. 流速、柱温与溶剂的选择 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35。 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。136. 积分参数的设定 积分参数的设定是非常重要的
6、。它主要由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又将反应不出杂质的存在情况。146. 最小峰面积的设定 其设定，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰 面积。普通样品测定时，通常为1/10 1/20（即相当于样品测
7、定浓度的0.1%0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。 同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。157. 保留时间的设定经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为止。168. 强力破坏试验l 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90放置24小时。l 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90放置24小时。l 强碱破坏 取原料适量，用
8、1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90放置24小时。l 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90放置24小时。l 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变l 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。179. 定量检测如有关物质的检查为定量检测，即为杂质对照品法，在上述项目的各项研究后，需增加线性试验以及一些必要的方法论证项目。1810. HPLC/UV二极管阵列检测器采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色谱峰的几点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。我室有一台该检
9、测器，曾多次做过该方面的工作。19薄 层 色 谱 法薄层色谱法由于既可检测具有紫外吸收的物质，又可检测不具有紫外吸收，因此也被广泛地应用。但由于其不具有准确定量的性质，故其应用受到一定的限制。 1. 展开剂的确定与HPLC法相同，配制含有1%浓度各中间体的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液进行试验，来确证展开剂的适用性。202 . 检测方法的确定可采用紫外灯下检测，由于通常只具有两种波长254mn和360nm，故测定有其局限性。采用显色的方法进行时，通常喷以显色剂后需立即检视。213 . 供试品溶液与对照溶液浓度的确定（灵敏度试验最小检出点样量的测定） 其原理与HPLC法相同。 最低检出
10、量可采用不断稀释样品溶液浓度，点样直 至观测不到为止。 最大点样量可采用不断增加样品溶液浓度，直至不 拖尾的浓度为准。 通常考虑到试验耐受性因素的影响，将供试品溶液 浓度设定为比最大点样量略小一些为好。 该项试验要求必须附有试验的点样图谱照片。 目前USP、BP、EP中的一些规定。 224 .定量的确定由于TLC法通常无法准确定量，故可采用配制一系列浓度的对照溶液来衡量杂质介于何种浓度之间的方法进行，但此法较为烦琐。23紫外分光光度法（UV法）在一些溶液剂的杂质检测中，也常采用在可见区某波长处测定样品溶液的吸收度值，以不超过某限度为准的方法。这里需注意的是，同时需附有溶剂、辅料（制剂时）的紫外
11、扫描图谱，以验证该法的专属性。 24有关物质在质量标准中的制订1. 通常在原料药的质量标准中，需制订有关物质检查项。制剂时，如经制剂工艺后，与原料药比较有关物质有所增加或经稳定性考核后，有关物质量有所增加，均应在质量标准中制订有关物质检查项，如未有明显增加，可考虑不予以制订。25有关物质在质量标准中的制订2. 质量标准中的系统适用性试验，应规定理论板数按主成分峰计应不低于多少（通常为2000） ，且最好能将相应的杂质（该杂质为最难分离的）订入，以用于系统适用性试验用溶液的配制，将杂质的浓度配制为主成分浓度的1%进行试验，从而确保本试验在各种条件下均可准确进行。该法已在USP、BP、进口样品和国
12、外药品资料中多次采用。26有关物质在质量标准中的制订2. 举例说明：如： 供试品溶液浓度为0.5mg/ml；对照溶液浓度为5g/ml（限度为1.0%）系统适用性试验用溶液： 对照品溶液浓度为0.5mg/ml；最难分离杂质对照品浓度为5g/ml（1.0%）27有关物质在质量标准中的制订3。系统适用性试验进行一强破坏试验，以验证分离度。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。28有关物质在质量标准中的制订4。再如：国家药品标准WS1-(X-350)-2004Z注射用奥
13、美拉唑钠的质量标准中规定：取供试品溶液，加3%过氧化氢溶液3ml，放置10分钟后，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性验证用溶液。色谱图中与主成分峰相邻的氧化降解产物峰与主成分峰的分离度应符合规定。29典 型 图 谱 分 析30有关物质在质量标准中的制订5。再如：进口的盐酸氨溴索质量标准中规定：取对照品5mg，加甲醇1ml溶解后，加甲醛1滴，置60加热5分钟，氮气吹干，残渣用水5ml溶解，再加流动相稀释至25ml，进样测定，使产生的杂质B（相对保留时间为0.8）与主成分峰的分离度应大于4.0。31有关物质在质量标准中的制订3. 制剂有关物质的检测方法一般应与其原料药有关物质的检测方法相同。含量测定方法也应尽量与有关物质测定方法相同，并最好稀释一定倍数。4. 如分离检测出若干个杂质峰，在制订总杂质限度的基础上可考虑制订单个杂质限度。5. 测定制剂时，辅料是否对测定有干扰。如有干扰（通常出峰较快），可考虑采用规定时间限度的方法予以排除。 32
