细胞产物分析技术细胞产物提取技术

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1、样品的预处理细胞产物的提取细胞产物的分离产物的分析鉴定经典分离方法红外光谱紫外可见光谱色谱分离法质 谱核磁共振谱细胞产物提取技术常用溶剂 提取方法l细胞产物的提取是采用适当的方法或手段以合适的溶剂将细胞中目的物质和其他成分进行分离的过程，经过提取所得的样品通常是混合物，成分较为复杂。l溶剂分子通过扩散、渗透或吸收等作用进入样品中， 然后通过样品内外浓度差异产生渗透和扩散作用将样品中的有机物提取出来。溶剂分子不断进出样品 直至样品和溶剂中的有机物浓度达到平衡。l对于气态样品，一般是将气体通过溶剂，气体中的有机物被溶剂吸收;或将气体通过固体吸附剂，称为吸附；l固体样品则是直接放在溶剂中，溶剂渗透到

2、固体样品而将有机物提取出来，通称提取；l液态样品也是用溶剂通过外力混合将有机物从液态样品转移到溶剂中，一般称为萃取。l进行细胞产物提取的两个方面：选用合适的溶剂；选择合适的提取方法。l常用溶剂：石油醚、己烷、庚烷、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、 水、甲酰胺 l溶剂极性是指溶剂对电荷的亲和能力，常用介电常数来比较溶剂的极性大小。介电常数又称电容率或相对电容率，表征电介质或绝缘材料电性能的一个重要数据，常用表示。它是指在同一电容器中用同一物质为电介质和真空时的电容的比值，表示电介质在电场中贮存静电能的相对能力。介电常数愈小绝缘性愈好。溶剂的极性增加，介

3、电常数增大。常用溶剂水最常用的溶剂l介电常数达80.4，是强极性溶剂，绝大多数有机溶剂的介电常数均比水小。l强极性溶剂，价廉、易得、使用安全；穿透能力很强，很容易进入样品中将亲水的强极性物质提取出来。常见的无机盐、单和低聚糖、鞣质、氨基酸、蛋白质及多肽、黏液质、果胶、有机酸、酚类、生物碱的盐类和苷类都能用水提取。常用溶剂水最常用的溶剂l可用稀酸或碱水提取样品。如酸性水可以使生物碱与酸作用成盐增加溶解度，而更容易提出。碱性水可使有机酸、黄酮、蒽酯和内酯及许多酚类有机物从样品中提取出来。l水常常会使细胞中的有机物发生变化，如水解和酶解。水提取液不易保存，易发生霉变，环境样品的水提取液易发生分解或聚

4、合反应。常用溶剂甲醇、乙醇和丙酮等亲水性有机溶剂l穿透能力也很强，可将大多数有机物质从样品中提 取出来，而样品中的无机盐、蛋白质、淀粉、果胶 和黏液质等物质大多数不被提取出来。l亲水性的醇类提取样品所需时间短，还能使蛋白质 凝固而破坏酶的活力，保证提取出的有机物不被水 解或酶解。l甲醇的极性高于乙醇，提取效率优于乙醇。但甲醇 沸点低，毒性较大。乙醇是最常用的有机溶剂，具 有低毒、价廉、沸点适中、便于回收利用等特点。常用溶剂亲脂性的石油醚、苯和氯仿等有机溶剂l选择性强，一般不能或不易提取出样品中的强极性 有机物，对弱极性有机物的提取也与所用的溶剂不 同而有显著的差异l可以针对性地从样品中提取出相

5、应的有机物，所得 有机物纯度较高。l对细胞中的油脂类成分具选择性提取功能。根据提 取目的不同,常使用石油醚或乙醚来萃取这类成分 。常用溶剂亲脂性的石油醚、苯和氯仿等有机溶剂l植物中所含的次生代谢产物成分较为简单或某一 成分含量较高时，可根据其极性大小或溶解性能 ，选择一种适当的溶剂把所需的成分提取出来， 而杂质留在植物残渣里。l挥发性大，易燃，有毒性，价格较高，操作和设 备要求高，穿透性很弱，需要长时间反复提取才 行。l大量有机物的提取，一般不使用亲脂性溶剂提取 方法。常用溶剂常用溶剂常用溶剂溶剂选择原则l相似相溶原理：即极性化合物易溶于极性溶剂，非 极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能

6、团 相似的彼此互溶。分子结构中极性基团的多少及取 代位置决定了其在不同溶剂中的溶解性。l惰性溶剂原则用溶剂从生物体和环境样品中提取有机物 选用的溶 剂最好有针对性，选用化学惰性的溶剂进行提取。化学惰性是指溶剂本身不能和有机物发生化学反应 而导致有机物结构变化。常用溶剂溶剂选择原则l 混合溶剂提取原则一种溶剂不能进行有效提取时，可将多种溶剂按 比例混合，用混合溶剂提取。 溶剂混合存在一个混溶问题，各溶剂间的溶解度决 定它们的相互混溶比例。在使用混合溶剂提取样品 时，不能用无法均匀混合的溶剂去提取样品。溶剂的混合，一般会出现完全不能混合、有限比 例混合和任意比例混合三种情况。三种混合情况的 形成主

7、要是取决于溶剂间的极性，强极性和弱极性 溶剂一般不易混合，亲脂性溶剂和亲水性溶剂也不 易混合。只有极性相当的溶剂可以很好的混合。常用溶剂溶剂选择原则l低沸点易挥发原则溶剂提取出样品后，要进行浓缩处理。以免为下一步的溶剂去除增加困难，应尽可能的选用低沸 点易挥发的溶剂。水的沸点是100，加上氢键的影响，挥发性不好，除去大量水比有机溶剂要困难得多。 常用溶剂溶剂毒性l危害的途径 经由皮肤接触引起的危害：有机溶剂蒸 气会刺激眼睛粘膜而使人流泪；与皮肤接 触会溶解皮肤油脂而渗入组织，干扰生理 机能、且因皮肤干裂而感染污物及细菌， 刺激表皮引起红肿及气泡，进入体内破坏 血细胞及骨髓。常用溶剂溶剂毒性l危

8、害的途径 经由呼吸器官吸入：有机溶剂蒸气由呼吸器官吸 入人体后，人往往会产生麻醉作用。蒸气吸入后 大部分经气管而达肺部并经血液或淋巴液传送至 其他器官，造成不同程度的中毒现象。人体肺泡 面积为体表面积数十倍以上，血液循环扩散速率 快，常会对呼吸道、神经系统、肺、肾、血液及 造血系统产生重大毒害。固有机溶剂对呼吸器官 引起之中毒现象，最受人重视。常用溶剂溶剂毒性l危害的途径 经由消化器官引起：有机溶剂经由消化道 引起危害主要是因为在污染溶剂蒸气场所 进食、抽烟或手指沾口等，首先进入受害 者口腔、经由食道进入胃肠，引起恶心、 呕吐现象，然后由消化系统危害到其他器 官。常用溶剂溶剂毒性l产生的生理作

9、用 中毒症状一般表现为头痛、疲怠、食欲不 振、头晕等，高浓度之急性中毒抑制中枢 神经系统，丧失意识而产生麻醉现象，初 期引起兴奋、昏睡、头痛、目眩、疲怠感 、意识消失等。低浓度引起慢性中毒则影 响血小板、红血球等造血系统，鼻孔、齿 龈及皮下组织出血，造成人体贫血现象。常用溶剂溶剂毒性l解决途径充分了解溶剂的性质，掌握规范操作方法加强个人防护，如戴口罩、面具、手套等加强自然与机械通风不要在实验室进食增加防范意识常用溶剂溶剂选择原则对于基本信息一无所知的样品常常用极性不同的溶剂进行梯度提取l传统提取方法浸提法 渗漉法 煎煮法 压榨法 回流提取法 连续提取法 水蒸汽蒸馏法l新型提取方法连续逆流萃提取

10、 微波萃取 超声提取 液泛法提取 组织破碎提取法 免加热提取 空气爆破提取 常温超高压提取 酶法提取 半仿生提取 超临界流体萃取提取方法浸提法 l加溶剂将样品浸没，并间歇式地振摇或搅拌，23d后 过滤出溶剂，再加新溶剂浸提样品，一般浸提3次后，样品中的绝大多数可提取物质都被转入到浸提液中，合 并提取液并浓缩可以得到提取物浸膏l室温下进行，对于热不稳定以及含有大量淀粉、果胶和 黏液质的动植物样品较适用。l该法简单易行，也适合大量样品的提取。l这种方法费时、提取效率低，用水作溶剂时，可以导致 霉变，因而该方法较适合用有机溶剂提取。l若必须用水作溶剂，可在水中加入适量的防腐剂(如苯 甲酸钠等)以防止

11、提取液发霉变质。提取方法渗漉法l用溶剂不断地淋洗样品，一般可在管状容器池中进行，上层 加溶剂淋洗，下层流出浸提液，当溶剂渗入上层样品后，溶 出液密度不断加大而向下层移动，上层不断添加的新溶剂或 稀浸提液置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地 进行。l渗漉法对药材的粒度及工艺技术条件要求较高，若条件操作不当，可影响渗漉效率，甚至影响渗漉过程的正常进行。此外，对新鲜及易膨胀药材、无组织结构的药材不宜使用。l比静止的浸提法效率要高，但需要大量的溶剂。提取方法压榨法l靠机械外力的作用直接挤压植物组织，使细胞破 裂，液体(油脂或汁液) 流出，适用于多汁液或多 油脂的植物l优点：不需溶剂，保持原汁原

12、味，避免溶剂残留 ，产物更安全，纯天然绿色产品；工序少，操作 简单，生产设备简易，造价低，可进行连续生产 ，生产成本低；螺旋式压榨提高工作效率。l缺点：提取效率低提取方法回流法 l将样品放入烧瓶中，加入溶剂 浸没，然后在烧瓶上接回流冷 凝器。烧瓶加热使溶剂沸腾并 形成回流，一般回流12h后，冷却过滤出溶剂，烧瓶中再加 新溶剂继续加热回流，反复操 作34次，合并提取液可得提取物。l提取效率高，但操作繁琐，不 适用于热不稳定物质的提取。提取方法连续回流法 l连续提取方式可以将纯溶 剂不断地浸提样品而始终 保持较高的浓度差，故提 取效率高。l操作简单，消耗溶剂少。l提取时间较长，提取出的 天然产物长

13、时间受热，因 而热不稳定物质不宜采用 连续提取方式。提取方法连续逆流提取l正向进料、反向进溶剂， 物料与溶剂的流动为逆向 连续动态流动，使药材和 溶媒能保持相对运动，使 料液浓度扩散更新持续作 用。l优点：提取速度快、收率 高、无反混现象、连续运 行l缺点：对药材物性形状粒 度要求较高提取方法连续逆流提取提取方法水蒸汽蒸馏法l在一定的温度下，任何一种液体都有其相应的蒸气 压，若为一混合溶液，则溶液蒸气压为各液体的蒸 气压之和，而且每种液体将显示各自的蒸气压，并 不被其它液体影响。l各种液体的分压只与它们各自纯物质的饱和蒸气压 有关，而与其它各组分无关。l在常压下若用水蒸气（或水）作为混合液体的

14、一相 ，就能在低于100的情况下将高沸点（高于100 ）有机物和水一起蒸出来。提取方法水蒸汽蒸馏法l对一些在水中溶解度较大的挥发性成分可用低沸点非极性溶剂如石油醚、乙醚抽提出来。l某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱等；l某些小分子的酸性物质如丹皮酚（将徐长卿加水浸泡，然后水蒸气蒸馏，蒸馏液用乙醚提取，醚提取液浓缩即析出丹皮酚结晶）。l植物中的挥发油大多在150300之间，但用水蒸气蒸馏都能在100逐渐随水蒸气一同蒸出。 提取方法水蒸汽蒸馏法水蒸汽蒸馏装置提取方法液泛法l l原理原理 利用溶剂蒸汽，增加液相利用溶剂蒸汽，增加液相 湍动，提高溶质扩散速率湍动，提高溶质扩散速率 因为不断有冷凝液

15、加入，因为不断有冷凝液加入， 保持了溶质与溶剂间的浓保持了溶质与溶剂间的浓 度梯度，明显提高了相间度梯度，明显提高了相间 的传质推动力的传质推动力l l缺点缺点 需要较高温度需要较高温度1. 三口烧瓶 2. 止回阀 3. 缓冲瓶 4. 虹吸管 5. 支管 6. 反应管 7. 冷凝管 8. 筛板提取方法超声波辅助提取法l超声波指频率高于20kHz、人的听觉阈以外的声波。1830年，人们用一大齿轮产生了超声波，之后超声技术广泛应用于家电和医疗卫生等领域。l超声波辅助提取法是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取细胞中有效成分的方法。 提取方法

16、超声波辅助提取法超声波提取的特点l超声提取时不需加热，避免了中药常规煎煮法、回 流法长时间加热对有效成分的不良影响，适用于对 热敏物质的提取。l超声提取是一个物理过程，在整个浸提过程中无化 学反应发生，不影响大多数药物有效成分的生理活 性。l提取物有效成分含量高，有利于进一步精制。提取方法超声波辅助提取法影响因素l时间对提取效果的影响超声提取的时间一般在10l00min以内即可得到较好的提取效果。原料不同，提取率随超声时间的变 化亦不同，如绞股蓝中绞股蓝总皂苷和黄连中黄连 素的提取，提取率随着超声时间的增加而增大；而 在益母草总生物碱和黄芩苷的提取中，分别在 40min和60min时提取率出现一个峰值。提取方法超声波辅助提取法影响因素l超声频率对提取效果的影响超声频率是影响有效成分提取率的主要因素之一。郭氏在对大黄中葸醌类、黄连中黄连素和黄芩中黄 芩苷的超