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1、肉桂地链霉菌的发酵工艺优化选取高产菌株 作为底盘细 胞底盘细胞培养形成单菌落发酵接合转移构建转化体系ST021菌株对底盘细胞 的目标产物 进行验证 ST021发酵工艺的优化种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取 物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1%发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸 钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01% ，抗坏血酸0.00019%，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙 0.25%， PH 6.7-6.8第一批发酵第六天测得ST021的效价为：0.32g/
2、L 第二批发酵第七天测得ST021的效价为：2.43g/L存在问题1.发酵过程中PH过高培养1天后的种子液 PH：8.05左右 第一批培养6天后的 发酵液PH：8.64 第二批培养7天后的 发酵液PH：7.25计划：1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到 理想的效价。 2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系 。 3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素 基因的导入做准备。 1.ST021抗性筛选将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr 菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗 性，部分对Kan有抗性。3.ST021转化体系的建立1.与游离型质粒的结合
3、转移对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落 涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生 长。 2 整合型质粒的结合转移将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转 化子，涂到含有Apr和Nali的高氏培养基上，仍能 生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位 点上。ST021单菌落发酵单单菌落 发发酵液PH 效价ST021-N18.880.653g/LST021-N28.440.509g/LST021-N38.820.833g/LST021-N47.328.676g/LST021-N58.711.052g/LST021-N68.8410.01g/L不同浓度豆油发酵豆油浓
4、浓度 发发酵液PH 效价2%8.900.635g/L4%8.441.729g/L6%8.322.952g/L补加豆 油6.883.442g/LST021单菌落发酵单单菌落发发酵液PH 效价N-7 9.06N-8 9.00N-9 8.98N-10 9.02N-11 8.74 0.789g/LST021-Kan单菌落发酵单单菌落 发发酵液PH 效价 Kan-28.94 8.5g/LKan-39.040.91g/L Kan-49.07 0.87g/L对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进 行发酵。菌落 效价N4-3 1.11g/LN6-3 1.00g/LKan-3 2.052g/L 对
5、N-4、N-6补加豆油发酵，第七天测发酵效 价菌落 发发酵液PH效价N-4加豆 油6.93 2.52g/LN-6加豆 油7.21 4.38g/L结合转移对ST021与整合型质粒进行结合转移，长出 疑似转化子，用pIB的验证引物进行验证， 证明PIB已经整合到ST 021的基因组上。Kan-2单菌落发酵编编号 PH效价19.20 1.64g/L29.07 7.05g/L39.24 2.83g/L4 9.16 9.10g/LN4单菌落发酵编编号PH 效价1 9.20 1.10g/L2 8.85 16.20g/L3 9.22 4.72g/L4 9.16 2.12g/LN6单菌落发酵编编号PH效价19
6、.23 5.87g/L28.3419.22g/L39.212.67g/L49.321.64g/LKan-2单菌落发酵编编号 PH效价28.63 _38.96 0.676g/L47.83 5.43g/L （ ? 135.71mg/25mL ）N4单菌落发酵编编号PH 效价1 8.83 _2 6.65 5.71g/L 3 8.81 0.571g/L4 8.95 0.556g/LN6单菌落发酵编编号PH效价18.732.43g/L 28.8138.8348.79ST021的敲除体系MonB，调控基因R的敲除载体构建好， 进行结合转移， 并长出转化子，将转化子划 线于涂有Apr和Nali的板子上进行验
7、证。调控基因R敲除载体构建好，进行了多次结 合转移。 构建调控基因MonH的敲除载体，利用重叠 延伸的方法将其同源臂及Apr片段连接起来 。ST021发酵(新的发酵培养基) 编编号PH 效价1 7.35 4.28g/L2 7.33 7.46g/L3 7.53 3.78g/L4 7.77 6.89g/L5 7.65 7.12g/L6 7.65 7.05g/L7 7.38 3.68g/L8 8.06 4.69g/L9 7.44 3.90g/LST021发酵(新的发酵培养基)编编号PH 效价1 6.97 6.8g/L2 7.94 1.8g/L3 7.32 4.2g/L4 7.35 4.8 g/L5
8、7.05 5.81g/L6 7.09 5.56g/L7 7.25 5.92g/L8 7.43 2.47g/L9 7.17 2.36g/LST021敲除体系调控基因R（负调控基因）进入到松弛培养 第五代，第四代在Apr、kan板上均能生长。 调控基因R（正调控基因）进入到松弛培养 第四代，挑单菌落30个于高氏培养基上。 调控基因MonH （正调控基因）挑了20个转 化子在Apr、Nali的高氏培养上验证。 MonB进入到松弛培养第三代，挑单菌落20 个于高氏培养基上生长。 正在构建ST021全基因敲除的载体。ST021抗性筛选将ST021分别划线于含有潮霉素、壮观霉素 、新霉素的高氏培养中，观察
9、ST021对这三 种抗生素的抗性。外源基因簇导入到ST021菌株中分别将含有iso-migrastatin、Rapamycin基 因簇的质粒转入到ST021的菌株中，等转化 子长出后，检测这两种抗生素在ST021中的 效价。ST021敲除体系进展 改用液体培养基对构建的敲除菌株进行松 弛培养。传2-3代之后用水把培养基洗掉， 将菌丝体涂在抗性培养基上进行筛选。 调控基因Mon（正调控基因）出现双交换的个 体，待提基因组验证（？）。 在斜面培养基上，MonB与调控基因MonR、 MonR均出现恢复到野生型的个体，继续采用液 体液体培养基对其进行传代。ST021全基因敲除 同样采用-Red重组系统
10、进行全基因敲除， 在ST021的阅读框外分别选取未知功能域处 长度为3211bp、3196bp作为上、下游同源 臂。 将Apr片段置换到上、下游同源臂之间，待 酶切验证。 将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因 簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004 进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长 出转化子，待验证。 将ST021原始菌株，进行单交换菌株 R分别涂 在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、 180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上, 分别看其所对应的抗性浓度。 继续对 R、 R、 H进行液体传代，每两天 传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次 ，涂在Apr的斜面培养基上。7天后在Apr板子上挑 单菌落继续涂在含Apr的培养基上。 全基因敲除将长出来验证过的转化子进行松弛培养，在固 体培养基传代第一代，液体传达第二代。其余的 转化子在Apr和Nali的高氏培养基上验证。
